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一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条制造技术

技术编号:15636575 阅读:326 留言:0更新日期:2017-06-14 20:26
一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条。本发明专利技术属分析检测领域,公开了检测小分子物质的免疫层析试纸条:将修饰牛血清白蛋白的荧光物质分别与检测抗原以及抗免疫球蛋白G抗体混合,喷涂在试纸条特定区域上做为检测线及质控线,标记特异性单克隆抗体的银纳米粒子(银消光探针)喷涂在试纸条结合垫。当样品溶液不存在待测物时,银消光探针与检测线上检测抗原结合,吸收了荧光物质的激发光或发射光而使检测线无荧光,而质控线有荧光;当样品溶液存在待测物时,银消光探针优先与待测物结合,此时结合在检测线上的银消光探针数量减少,而结合在质控线上的银消光探针数量增加,导致试纸条检测线荧光增加,而质控线荧光下降。本发明专利技术较传统免疫层析试纸条检测小分子物质的消线判读模式更灵敏。

【技术实现步骤摘要】
一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条
本专利技术属于免疫学分析检测
,涉及一种检测小分子物质的银纳米粒子消减荧光免疫层析试纸条。
技术介绍
免疫层析技术具有速度快、抗基质干扰能力强、操作简便等优点,是现场快速筛查的首选方法,也是食品安全、医药卫生、环境保护等领域创新研究的热点。近年来,基于免疫层析技术的胶体金试纸条得到了广泛应用,然而传统的胶体金免疫层析方法因检测灵敏度不高,在检测某些微量或痕量分析物如食品中污染的真菌毒素等方面仍存在较大缺陷。因此,提高免疫层析方法的检测灵敏度对于拓延其适用范围具有非常重要的意义。荧光标记物与传统胶体金标记物相比,具有更高的信号强度,可提高试纸条检测灵敏度。利用试纸条检测小分子待测物,通常使用竞争反应模式,即检测线上的人工抗原与待测物共同竞争荧光物质标记的抗体,检测信号强度与待测物含量成反比关系,当待测物含量处于较低水平时,较强的检测信号对待测物含量的微小变化并不敏感,因此灵敏度偏低。在竞争免疫层析试纸条上构建荧光消减模式可以使待检物浓度与荧光强度成正比,即待检物在痕量存在时荧光信号从无到有,可以提高检测灵敏度和准确性。相较于常规胶体金粒子,银纳米粒子具有更高的摩尔消光能力,因此具有更强的荧光消减能力,从而可进一步提高试纸条检测灵敏度。此外,银纳米粒子的消光光谱随粒子粒径增加而增大,银纳米粒子粒径从10nm到100nm,对应的表面等离激元共振(SPR)吸收峰从400nm到500nm,拓宽了胶体金荧光“淬灭”免疫层析试纸条荧光物质的选择范围(金纳米粒子SPR吸收峰在500nm以上)。
技术实现思路
本专利技术的银纳米粒子消光免疫层析试纸条基于银纳米粒子吸收荧光物质的激发光或发射光而导致其荧光信号减弱,用于快速定性和定量检测小分子物质。银纳米粒子消光免疫层析试纸条的结构组成见附图1所示,包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成,其中滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端,吸水纸层叠在NC膜另一端,五部分整体固定在粘性卡纸上。荧光物质-BSA与待测小分子物质检测抗原混合固定在试纸条检测线,荧光物质-BSA与IgGFc片段特异性识别抗体(二抗)混合固定在试纸条对照线(质控线),银纳米粒子与小分子物质特异性抗体复合物(银消光探针)固定在试纸条结合垫上,待检物质溶液通过滤纸过滤,经样本垫进入结合垫,待测小分子与银消光探针结合,在吸水纸毛细作用下,待检溶液在试纸条上流动,继续前进到达检测线,未与待测小分子结合的银消光探针与检测线上的检测抗原结合,其余的银消光探针继续前进到达质控线与二抗结合。加样十至二十分钟后,试纸条在荧光读取仪中读取检测线和质控线的荧光数值。由于银纳米粒子特异性的吸收荧光物质的激发光或发射光,导致检测线上的荧光值与银粒子数量成反比例,而与待检小分子物质的浓度成正比例关系,样品中不含待检小分子物质时,检测线上没有荧光信号。本专利技术所述的一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,制备方法为:(1)荧光物质与牛血清白蛋白(简称BSA)通过羧基和氨基间共价键结合所选用的荧光物质为荧光微球、量子点微球、量子点或荧光染料;荧光物质需先经过表面氨基或羧基修饰,再与BSA上的羧基或氨基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)活化共价结合,得荧光物质-BSA;荧光物质的最适激发波长和最大发射波长二者至少其一在400nm至500nm之间;(2)制备银消光探针:1)采用种子逐步生长法合成银纳米粒子,对每一步的银粒子测定紫外吸收峰,当峰值达到与所选用的配对荧光物质的最大激发波长或发射波长一致时停止生长;具体方案为:a)银种子制备:在100mL体系中调整柠檬酸钠(简称SC)浓度至5mM,单宁酸(简称TA)0.1mM,加热剧烈搅拌,一开始沸腾,立即加入1mL25mMAgNO3,溶液马上变成亮黄色,补足体系体积至100mL,得到种子银大小约15nm的种子银溶液;b)银粒子逐步生长:在100mL体系中移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,温度设定到90℃,加入0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM),1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,搅拌30min;重复"移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM)和1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,90℃搅拌30min"这一过程,紫外扫描监测银纳米粒子SPR吸收峰的变化情况,直到获得SPR吸收峰与配对荧光材料的最大激发波长或发射波长相同,得银纳米粒子;2)银纳米粒子与待检小分子单克隆抗体结合:取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约为1010至1012),5000转至10000转离心10min,弃上清;沉淀重悬于1mL含待检小分子抗体(IgG含量1μg至80μg)的0.1MpH7.0-7.5硼酸溶液;20℃磁力搅拌器上搅动2h,5000转至10000转离心10min,弃上清;沉淀重悬于pH7.0至7.5含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中,5min后,5000转至10000转离心10min,沉淀重悬于0.25mLpH7.0至7.5含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中,得银消光探针,4℃保存备用;(3)检测抗原(小分子-BSA)制备:将小分子待测物与BSA通过共价键结合;先活化小分子待测物上非抗体识别位点的基团,然后与BSA分子上氨基或羧基通过共价键结合得小分子待测物-BSA;该方法与制备小分子人工抗原的方法相同;(4)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装:试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜(简称NC膜)和吸水纸等五部分组成;其中滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端,吸水纸层叠在NC膜另一端,五部分整体固定在粘性卡纸上;其中结合垫上承载银消光探针,每个试纸条结合垫固定探针数量为106至108个;检测线上固定待检小分子的检测抗原和荧光物质-BSA,每个试纸条检测线上固定小分子检测抗原0.1μg至0.5μg;质控线上固定抗免疫球蛋白G(简称IgG)抗体即二抗和荧光物质-BSA,每个试纸条质控线上固定抗IgG抗体10ng至100ng;检测线和质控线上固定荧光物质-BSA的量均以荧光物质质量计算为1ng至50ng;距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线;切割成宽度3.8mm每条,装入试纸条卡盒中,卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同,内有试纸条固定卡槽,在试纸条的滤纸位置留有加样孔,在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口;试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。进一步的,前述试纸条在具体领域中的细化应用:本专利技术还公开了,检测黄曲霉毒素M1的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,待测物质为黄曲霉毒素M1(简称AFM1),荧光物质为异硫氰酸荧光素微球;制备方法如下:(1)氨基表面异硫氰酸荧光素微球与BSA结合:25mL磷酸盐缓冲液(简称PB,0.01M,pH6.0)中,加入20mg氨基表面异硫氰酸荧光素微球,5mgBSA,200μgEDC,室温搅拌45min后,再加入200μgEDC,25mgBSA,室温搅拌1h,8000转离心10min,沉淀复溶于2mL水中,得本文档来自技高网...
一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条

【技术保护点】
一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,其特征是制备方法为:(1)荧光物质与牛血清白蛋白(简称BSA)通过羧基和氨基间共价键结合所选用的荧光物质为荧光微球、量子点微球、量子点或荧光染料;荧光物质需先经过表面氨基或羧基修饰,再与BSA上的羧基或氨基通过1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)活化共价结合,得荧光物质‑BSA;荧光物质的最适激发波长和最大发射波长二者至少其一在400nm至500nm之间;(2)制备银消光探针:1)采用种子逐步生长法合成银纳米粒子,对每一步的银粒子测定紫外吸收峰,当峰值达到与所选用的配对荧光物质的最大激发波长或发射波长一致时停止生长;具体方案为:a)银种子制备:在100mL体系中调整柠檬酸钠(简称SC)浓度至5mM,单宁酸(简称TA)0.1mM,加热剧烈搅拌,一开始沸腾,立即加入1mL 25mM AgNO

【技术特征摘要】
1.一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,其特征是制备方法为:(1)荧光物质与牛血清白蛋白(简称BSA)通过羧基和氨基间共价键结合所选用的荧光物质为荧光微球、量子点微球、量子点或荧光染料;荧光物质需先经过表面氨基或羧基修饰,再与BSA上的羧基或氨基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)活化共价结合,得荧光物质-BSA;荧光物质的最适激发波长和最大发射波长二者至少其一在400nm至500nm之间;(2)制备银消光探针:1)采用种子逐步生长法合成银纳米粒子,对每一步的银粒子测定紫外吸收峰,当峰值达到与所选用的配对荧光物质的最大激发波长或发射波长一致时停止生长;具体方案为:a)银种子制备:在100mL体系中调整柠檬酸钠(简称SC)浓度至5mM,单宁酸(简称TA)0.1mM,加热剧烈搅拌,一开始沸腾,立即加入1mL25mMAgNO3,溶液马上变成亮黄色,补足体系体积至100mL,得到种子银大小约15nm的种子银溶液;b)银粒子逐步生长:在100mL体系中移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,温度设定到90℃,加入0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM),1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,搅拌30min;重复"移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM)和1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,90℃搅拌30min"这一过程,紫外扫描监测银纳米粒子SPR吸收峰的变化情况,直到获得SPR吸收峰与配对荧光材料的最大激发波长或发射波长相同,得银纳米粒子;2)银纳米粒子与待检小分子单克隆抗体结合:取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约为1010至1012),5000转至10000转离心10min,弃上清;沉淀重悬于1mL含待检小分子抗体(IgG含量1μg至80μg)的0.1MpH7.0-7.5硼酸溶液;20℃磁力搅拌器上搅动2h,5000转至10000转离心10min,弃上清;沉淀重悬于pH7.0至7.5含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中,5min后,5000转至10000转离心10min,沉淀重悬于0.25mLpH7.0至7.5含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中,得银消光探针,4℃保存备用;(3)检测抗原(小分子-BSA)制备:将小分子待测物与BSA通过共价键结合;先活化小分子待测物上非抗体识别位点的基团,然后与BSA分子上氨基或羧基通过共价键结合得小分子待测物-BSA;该方法与制备小分子人工抗原的方法相同;(4)银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装:试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜(简称NC膜)和吸水纸等五部分组成;其中滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端,吸水纸层叠在NC膜另一端,五部分整体固定在粘性卡纸上;其中结合垫上承载银消光探针,每个试纸条结合垫固定探针数量为106至108个;检测线上固定待检小分子的检测抗原和荧光物质-BSA,每个试纸条检测线上固定小分子检测抗原0.1μg至0.5μg;质控线上固定抗免疫球蛋白G(简称IgG)抗体即二抗和荧光物质-BSA,每个试纸条质控线上固定抗IgG抗体10ng至100ng;检测线和质控线上固定荧光物质-BSA的量均以荧光物质质量计算为1ng至50ng;距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线;切割成宽度3.8mm每条,装入试纸条卡盒中,卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同,内有试纸条固定卡槽,在试纸条的滤纸位置留有加样孔,在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口;试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。2.检测黄曲霉毒素M1的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,其特征在于制备方法如下:待测物质为黄曲霉毒素M1(简称AFM1),荧光物质为异硫氰酸荧光素微球;(1)氨基表面异硫氰酸荧光素微球与BSA结合:25mL磷酸盐缓冲液(简称PB,0.01M,pH6.0)中,加入20mg氨基表面异硫氰酸荧光素微球,5mgBSA,200μgEDC,室温搅拌45min后,再加入200μgEDC,25mgBSA,室温搅拌1h,8000转离心10min,沉淀复溶于2mL水中,得荧光微球-BSA,4℃保存备用;(2)银消光探针合成:1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长:a)银种子制备:在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM,单宁酸(TA)0.1mM,加热剧烈搅拌,一开始沸腾,立即加入1mLAgNO3(25mM),溶液马上变成亮黄色,补足体系体积至100mL,得到种子银大小约15nm的种子银溶液;b)银粒子逐步生长:在100mL体系中移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,温度设定到90℃,加入0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM),1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,搅拌30min;重复"移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM)和1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,90℃搅拌30min"这一过程16次,获得SPR吸收峰为494nm的银纳米粒子,与异硫氰酸荧光素微球最大激发光一致;2)银纳米粒子与抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体结合:取1mL银纳米粒子溶液,粒子数约6×1010个,5000转离心10min,弃上清;沉淀重悬于1mL含AFM1单抗20μg的0.1MpH7.4硼酸溶液;20℃磁力搅拌器上搅动2h,离心10min,弃上清;重悬于pH7.4含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中,5min后,5000转离心10min,沉淀重悬于0.25mLpH7.4含0.1%(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液,得银消光探针溶液,4℃保存备用;(3)合成AFM1检测抗原:将1mgAFM1、0.5mg琥珀酸酐和2mL吡啶混合,120℃加热回流3h,氮气吹干后用200μL二甲基甲酰胺(简称DMF)溶解,加入1mgN,N'-二环己基碳二亚胺(简称DCC)和1mgN-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS),室温搅拌4h,将混合液10000转离心10min,取上清液逐滴加入2mL含10mgBSA的0.13M碳酸氢钠溶液中;室温缓慢搅拌过夜,转入4℃磷酸盐缓冲生理盐水(简称PBS,0.01M,pH7.4)中透析72h;(4)银纳米粒子消光疫层析试纸条的组装:试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成;其中,样品垫用50mMpH7.4的磷酸盐缓冲溶液(包含1%的BSA,0.5%的吐温20和0.05%的叠氮钠)浸润,并于60℃干燥2h;结合垫用0.01M的PBS(pH7.5)缓冲溶液(包含0.2%吐温20和2%蔗糖)浸润,于60℃干燥4h,银消光探针溶液稀释10倍后以3μL/cm的浓度喷涂在结合垫上;将检测抗原(1.2mg/mL)与荧光微球-BSA(100μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线,驴抗鼠IgG(0.2mg/mL)与荧光微球-BSA(100μg/mL)混合后喷涂于NC膜的质控线上,设置各线喷涂量均为0.75μL/cm,将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h;所述商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理,直接使用;滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端,吸水纸层叠在NC膜另一端,五部分整体固定在粘性卡纸上;距离检测线4.0mm至6.0mm处喷涂质控线;切割成宽度3.8mm每条,装入试纸条卡盒中,卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同,内有试纸条固定卡槽,在试纸条的滤纸位置留有加样孔,在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口;试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。3.检测猪尿中沙丁胺醇的银纳米粒子消光免疫层析试纸条,其特征在于制备方法如下:待测物质为沙丁胺醇,荧光物质为最大发射波长620nm的羧基表面量子点微球;(1)最大发射波长620nm的羧基表面量子点微球与BSA结合:25mLPB(0.01M,pH6.0)中,加入10mg羧基表面量子点微球,200μgEDC,室温搅拌20min后,再加入5mLBSA水溶液(0.5%,w/v),室温搅拌1h,8000转离心10min,沉淀复溶于2mL水中,得量子点微球-BSA,4℃保存备用;(2)银消光探针合成:1)银纳米粒子的合成包括种子生成及逐步生长;a)银种子制备:在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM,单宁酸(TA)0.1mM,加热剧烈搅拌,一开始沸腾,立即加入1mLAgNO3(25mM),溶液马上变成亮黄色,补足体系体积至100mL,得到种子银大小约15nm的种子银溶液;b)银粒子逐步生长:在100mL体系中移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,温度设定到90℃,加入0.5mLSC(25mM),1.5mLTA(2.5mM),1mLAgNO3(25mM),补足体系体积至100mL,搅拌30min;重复"移除19.5mL反应液,加入16.5mL水,0.5mLSC(25...

【专利技术属性】
技术研发人员:熊勇华江湖郭亮李响敏赖卫华聂丽娟
申请(专利权)人:南昌大学
类型:发明
国别省市:江西,36

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