急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。本发明专利技术的试剂盒所包被抗体采用抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体作为包被抗体，将所述卵黄抗体用来检测哺乳动物病原具有灵敏度高、价格便宜、具有动物福利保护的特点，试剂盒精度高，检测简单，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种试剂盒及其制备方法，尤其涉及急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
自2009年以来，早期死亡综合症(EMS)，又称急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)给亚洲，特别是东南亚和中国的对虾养殖产业造成了前所未有的冲击。除了大规模减产外，该疾病还带来了诸多负面问题，例如：对虾养殖就业问题、社会福利问题、对虾供求问题和全球对虾总体价格问题等等。2013年5月，美国亚利桑那大学水产病理实验室(μAZ-APL)定义急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)病原为副溶血弧菌的特异菌株，该菌株能够产生毒素并诱导健康对虾致病。2014年，在世界范围内普遍证实目前APHND的病因与副溶血弧菌所携带的毒素质粒所表达的PirA和PirB两种毒素相关。目前针对该疾病的诊断集中在对毒素质粒的基因检测。现阶段已出现了一种商业化的基因检测试剂盒和三种通过基础研究得出的不同引物设计得到的诊断方法。CN103667498A公开了副溶血性弧菌的检测方法。所述方法用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因。检测方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外围引物的验证；交叉引物恒温扩增反应体系的建立；交叉引物恒温扩增程序；扩增产物的检测。CN104360065A公开了检测副溶血性弧菌的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003。现阶段的诊断方法存在的不足之处：(1)基因诊断需要PCR仪器以及复杂的操作过程，且时间一般在4个小时以上，不利于基层以及现场对疫情的快速诊断。而且目前该诊断方法在国内还没有商品化的产品，全球范围内的三种基因检测方法均由国外提供，其中一种已得到商品化；(2)基因诊断只能检测是否存在毒素表达基因，并不能诊断出毒素是否得以表达。而急性肝胰腺坏死综合症得根本原因是表达的毒素蛋白对机体的损伤，因此只有检测毒素蛋白才能更准确地判断疫病的爆发，减少假阳性；(3)目前的基因诊断技术只有95％的准确性，还有待进一步提高；(4)试剂盒的检测效率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供急性肝胰腺坏死综合症专用检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒通过特异性卵黄多克隆抗体提高检测灵敏度，同时降低检测的操作难度。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。作为试剂盒，酶标板和酶标检测抗体是其核心成分，只要有这两种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分，比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照，可以与上述三种成分配套组装在一个试剂盒中，也可以单独提供，因此本专利技术中试剂盒可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本专利技术优选包括这些辅助成分，以方便使用。优选地，所述特异性卵黄抗体为用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体。本专利技术中，所述的pirA和pirB作为一种毒素蛋白，通过基因工程手段从副溶血弧菌中获得，作为一种特异性可产生特异性抗体的蛋白，其产生的抗体具有抗急性肝胰腺坏死综合症，相比于直接用副溶血弧菌直接免疫产生抗体，以pirA和pirB蛋白免疫产生的抗体，专一性更强，效果更好；除此之外，通过pirA和pirB免疫产蛋禽类产生的卵黄抗体，相较于别的抗体，抗性更强，效率更高。本专利技术中制备多克隆抗体的方法，是目前比较成熟的技术，具体地，可以用纯化的病毒或者重组表达的病毒蛋白免疫动物，分离血清或卵黄，并通过沉淀离心、层析等方法从血清或卵黄中提取抗体。本专利技术中的特异性卵黄抗体是将重组表达的病毒pir蛋白免疫蛋鸡后通过硫酸铵沉淀法和亲和层析方法得到。优选地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示片段，所述序列如下：MSNNIKHETDYSHDWTVEPNGGVTEVDSKHTPIIPEVGRSVDIENTGRGELTIQYQWGAPFMAGGWKVAKSHVVQRDETYHLQRPDNAFYHQRIVVINNGASRGFCTIYYH。优选地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQIDNO.2所示片段，所述序列如下：MTNEYVVTMSSLTEFNPNNARKSYLFDNYEVDPNYAFKAMVSFGLSNIPYAGGFLSTLWNIFWPNTPNEPDIENIWEQLRDRIQDLVDESIIDAINGILDSKIKETRDKIQDINETIENFGYAAAKDDYIGLVTHYLIGLEENFKRELDGDEWLGYAILPLLATTVSLQITYMACGLDYKDEFGFTDSDVHKLTRNIDKLYDDVSSYITELAAWADNDSYNNANQDNVYDEVMGARSWCTVHGFEHMLIWQKIKELKKVDVFVHSNLISYSPAVGFPSGNFNYIATGTEDEIPQPLKPNMFGERRNRIVKIESWNSIEIHYYNRVGRLKLTYENGEVVELGKAHKYDEHYQSIELNGAYIKYVDVIANGPEAIDRIVFHFSDDRTFVVGENSGKPSVRLQLEGHFICGMLADQEGSDKVAAFSVAYELFHPDEFGTEK。本专利技术中，所述pirA和pirB蛋白的氨基酸序列是特异性的产生特异性的抗体针对急性肝胰腺坏死综合症，灵敏度高，效果显著。优选地，所述酶标检测抗体为酶标记的鼠源抗PirA和PirB毒素蛋白的多克隆抗体。优选地，所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体，优选为辣根过氧化物酶标记的检测抗体。优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液和洗涤液。优选地，所述样品稀释液为pH7-7.5的磷酸盐缓冲液；优选为pH7.2的磷酸盐缓冲液。优选地，所述洗涤液为pH9-10的碳酸盐缓冲液；优选为pH9.6的碳酸盐缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括封闭液和终止液。优选地，所述封闭液为含1％牛血清蛋白的洗涤液。优选地，所述终止液为硫酸溶液。优选地，所述试剂盒还包括酶底物溶液。优选地，所述酶底物溶液包含邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，优选3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。优选地，所述阳性对照为包含纯化后pir毒素蛋白的溶液。优选地，所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。另一方面，本专利技术还提供了一种如第一方面所述的检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；(2)用所述特异性卵黄抗体包被空本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：酶标板和酶标检测抗体；其中，所述酶标板上包被有抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体，所述酶标检测抗体为酶标记的抗急性肝胰腺坏死综合症的多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性卵黄抗体为用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；优选地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段；优选地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQIDNO.2所示的片段。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标检测抗体为酶标记的鼠源抗PirA和PirB毒素蛋白的多克隆抗体；优选地，所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体，优选为辣根过氧化物酶标记的检测抗体。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液和洗涤液；优选地，所述样品稀释液为pH7-7.5的磷酸盐缓冲液；优选为pH7.2的磷酸盐缓冲液；优选地，所述洗涤液为pH9-10的碳酸盐缓冲液；优选为pH9.6的碳酸盐缓冲液。5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液和终止液；优选地，所述封闭液为含1％牛血清蛋白的洗涤液；优选地，所述终止液为硫酸溶液。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶底物溶液；优选地，所述酶底物溶液包含邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，优选3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；优选地，所述阳性对照为包含纯化后pirA和pirB毒素蛋白的溶液；优选地，所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。8.一种如权利要求1-7任一项所述的检测急性肝胰腺坏死综合症的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)用pirA和pirB蛋白免疫产蛋禽类后提取抗急性肝胰腺坏死综合症的特异性卵黄抗体；(2)用所述特异性卵黄抗体包被空白酶标板，得到包被的酶标板；(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒；任选地，还包括将样品稀释液、洗涤液、封闭液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁振强，
申请(专利权)人：深圳市宝舜泰科技产业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44