一种抗生素自供能适配体传感器的制备方法技术

一种自供能抗生素适配体传感器的制备方法本发明专利技术公开了一种自供能抗生素适配体传感器的制备方法。它是基于酶生物燃料电池（EBFC）输出性能的变化实现抗生素的检测。自供能传感的设计主要集中于EBFC的阳极，DNA共轭体修饰于阳极表面，其空间位阻效应影响阳极燃料葡萄糖的质子传输，开路电压较小。当目标抗生素存在时，修饰于阳极表面的适配体识别抗生素药物导致DNA共轭体脱离，此时，阳极可有效催化葡萄糖氧化，EBFC开路电压增大，开路电压变化值与抗生素浓度呈比例关系，从而实现抗生素药物的检测。该传感器检测过程中无需额外供电设备、成本低廉、抗干扰能力强，适配体识别作用使该传感器具有高选择性。因此，该发明专利技术构建自供能抗生素生物传感器能实现抗生素药物简单、快速、灵敏、高效检测。

【技术实现步骤摘要】
一种抗生素自供能适配体传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于酶生物燃料电池的抗生素自供能适配体传感器的制备方法。抗生素存在影响酶生物燃料电池性能，通过酶生物燃料电池开路电压变化，实现目标抗生素药物简单、快速、灵敏、高效检测。
技术介绍
酶生物燃料电池（EBFC）是在生物酶催化作用下，利用可再生燃料提供可持续能源的一种特殊的燃料电池。基于EBFC的自供能生物传感器，是一类分析物浓度直接与电池输出信号呈比例关系的传感器。与传统传感器相比，自供能生物传感器检测过程中无需施加额外电源，其具体优点主要表现在：（1）设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，仅需两根电极，即EBFC的阴阳两极，便可实现检测；（2）抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；（3）能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。抗生素在各种常见病与细菌性疾病中发挥着不可磨灭的作用。但使用抗生素药物却像一把“双刃剑”，在畜牧业养殖过程中，长期滥用抗生素药物会导致动物源性食品肉、奶、蛋、水产品等抗生素药物残留。如人们长期摄入抗生素药物残留超标的动物源性食品，会在人体内蓄积，产生多种危害，如引起过敏反应、导致病源菌产生耐药性、引起组织器官病变或癌变。可见，建立简单、快速、准确、灵敏的食品中抗生素药物残留的检测方法，对促进人类社会健康，畜牧业持续健康发展至关重要。最常用检测抗生素药物残留的方法主要有：微生物检测法、色谱法、免疫分析法与DNA分子技术。虽然抗生素药物残留检测较多，但或准确度欠佳、灵敏度不够；或步骤冗长、操作繁琐；或依赖大型仪器、分析成本高昂，难以满足日益增长的准确、简单、快速、高灵敏的检测需求。本专利技术针对上述问题，基于酶生物燃料电池构建抗生素自供能生物传感器。EBFC的组装是自供能生物传感器设计的核心，本专利技术的自供能设计主要集中EBFC的阳极，DNA共轭体，二氧化硅@金纳米粒子-DNA链（SiO2@AuNPs-csDNA），通过碱基配对作用，连接于修饰了适配体/葡萄糖氧化酶（GOx/apt）的EBFC阳极表面，由于DNA共轭体的空间位阻效应，阻碍葡萄糖在体系中的质子传输，进而影响生物阳极的催化性能。当抗生素存在时，适配体特异性识别抗生素分子，DNA共轭体SiO2@AuNPs-csDNA从电极表面脱离，此时，生物阳极可高效催化葡萄糖氧化，进而EBFC输出电压增加，从而检测抗生素药物。此专利技术简单、方便、特异性强，无需额外供电设备，易于实现抗生素药物现场实时监测，力争解决人类社会广泛关注的食品安全问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于酶生物燃料电池的自供能生物传感器制备方法，实现抗生素药物的超高灵敏、高选择性检测，力争解决人类社会广泛关注的食品安全问题。本专利技术的技术方案如下：一种DNA共轭体，二氧化硅@金纳米粒子-DNA链（SiO2@AuNPs-csDNA），的制备方法，它由下列步骤组成：步骤1.SiO2的制备：将一定量的四氧基硅烷（TEOS）加入到氨水、乙醇与水的混合溶液中，其中TEOS浓度为5%~15%，室温下搅拌3~5h，过量的TEOS与氨水离心洗涤，60~80°C下干燥。随后，加入一定量的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌5~8h，洗涤干燥；步骤2.SiO2@AuNPs的制备：100~1000µL浓度为10nM的AuNPs加入到100~500µL1mgmL-1氨基化的SiO2溶液中，孵育过夜，离心去除过量的AuNPs，定容得到一定浓度的SiO2@AuNPs；步骤3.SiO2@AuNPs-csDNA的组装：将二硫苏糖醇（DTT）活化后的适配体部分互补的DNA链（csDNA）与SiO2@AuNPs室温下孵育2h，随后加入浓度为1~5mM巯基己醇（MCH）反应0.5~1h，封闭活性位点，离心去除过量的MCH，沉淀物重新分散在pH7.4的缓冲溶液中，得到SiO2@AuNPs-csDNA，其组装过程如图1。一种EBFC生物阳极SiO2@AuNPs-csDNA/apt/GOx/AuNPs生物阳极的制备方法，由下列步骤组成：步骤1.30~50μL浓度为50~100nM的AuNPs滴涂在碳纸电极表面（0.25cm2），37°C下干燥2~4h，1~10mgmL-1EDC和NHS的溶液中浸泡0.5~1h，随后用二次水冲掉电极表面多余的EDC和NHS；步骤2.将在步骤1中活化的电极浸泡在500~1000µL10~50mgmL-1的GOx与1~5μM适配体的混合溶液中孵育12~24h，然后用二次水反复洗涤后，置于4°C下备用；步骤3.将20~50µL0.5~2mgmL-1SiO2@AuNPs-csDNA溶液滴涂于步骤2中制得的电极表面，在37°C下反应2~4h，制得SiO2@AuNPs-csDNA/apt/GOx/AuNPs生物阳极，置于4°C下存贮备用。一种EBFC生物阴极laccase/PDA/AuNPs的制备方法，由以下步骤组成：将20~50µL10~100nMAuNPs溶液滴在碳纸电极表面，37°C下干燥2~4h，随后将去浸泡在4~8mMpH8.5的多巴胺溶液中，反应2~6h，超纯水清洗过量未反应的多巴胺溶液。接着在电极滴涂20~50µL20~60mgmL-1漆酶（laccase），孵育12~24h，超纯水反复洗涤后，置于4°C下存贮备用。一种基于EBFC的自供能抗生素生物传感器的搭建及测量如图2所示，由下列步骤组成：步骤1.在不引入目标抗生素时，测量EBFC阴阳两极的EOCV，记为E0OCV；步骤2.引入目标抗生素后，不同浓度的目标抗生素与生物阳极在37°C下孵育1~6h后，再次测量EBFC的EOCV；上述搭建的无膜葡萄糖/氧气酶生物燃料电池的支持电解液为含5mM葡萄糖pH7.4的100mMPBS缓冲体系，检测设备如图3。基于酶生物燃料电池的自供能抗生素生物传感器用于超灵敏检测抗生素药物原理如图3所示：在无目标抗生素存在时，SiO2@AuNPs-csDNA/apt/GOx/AuNPs生物阳极由于DNA共轭体SiO2@AuNPs-csDNA的存在，阻碍了葡萄糖在体系中的质子传输，GOx几乎无法实现对葡萄糖的催化氧化，此时，EBFC输出电压相对较小。当目标抗生素存在时，由于适配体特异性捕获目标物使其构型发生变化，此时DNA共轭体SiO2@AuNPs-csDNA，脱离阳极表面，不再阻碍葡萄糖在体系中质子传输，GOx可实现对葡萄糖的高效催化氧化，此时EBFC开路电压增大。随着引入目标抗生素浓度的增加，脱离阳极表面的DNA共轭体增加，葡萄糖质子传输效率增加，导致EBFC的开路电压增大，通过开路电压增加值与目标抗生素对应关系得出目标抗生素含量。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点：本专利技术提供了一种基于酶生物燃料电池的自供能抗生素适配体传感器，实现目标抗生素高灵敏、高选择检测，相对现有的抗生素检测方法，具有以下特点：（1）本专利技术所述基于EBFC的自供能生物传感器，检测过程中无需外加电源，仅需两根电极，即生物燃料电池的阴阳两极，整个检测设备简单，便是实现现场实时监本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自供能抗生素适配体传感器的制备方法，其特征是：酶生物燃料电池的构建。

【技术特征摘要】
1.一种自供能抗生素适配体传感器的制备方法，其特征是：酶生物燃料电池的构建。2.根据权利要求1所述的酶生物燃料电池，其特征是：酶生物燃料电池阴阳两极的组装。3.根据权利要求2所述的酶生物燃料电池阳极的组装，其特征是它由下列步骤组成：步骤1.30~50μL浓度为50~100nM的AuNPs滴涂在碳纸电极表面（0.25cm2）在37°C下干燥2~4h，1~10mgmL-1EDC和NHS的溶液中浸泡0.5~1h，随后用二次水冲掉电极表面多余的EDC和NHS；步骤2.将步骤1中活化的电极浸泡在500~1000µL10~50mgmL-1的GOx与1~5μM适配体的混合溶液中孵育12~24h，然后用二次水反复洗涤后，置于4°C下备用；步骤3.将20~50µL0.5~2mgmL-1DNA共轭体SiO2@AuNPs-csDNA溶液滴涂于步骤2中制得的电极表面，在37°C下反应2~4h，制得SiO2@AuNPs-csDNA/apt/GOx/AuNPs生物阳极。4.根据权利要求书3所述的DNA共轭体SiO2@AuNPs-csDNA的制备，其特征是它由下列步骤组成：步骤1.SiO2的制备：将一定量的四氧基硅烷（TEOS）加入到氨水、乙醇与水的混合溶液中，其中TEOS浓度为5%~15%，室温下搅拌3~5h，过量的TEOS与氨水离心洗涤，60~80°C下干燥；随后，加入一定量的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下搅拌5~8h，洗涤干燥；步骤2.SiO2@AuNPs的制备：100~...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖盼盼，侯婷，李峰，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37