DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用。本发明专利技术公开的DMD基因捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；N个亚探针满足N个亚探针能覆盖DMD基因的全部序列；在DMD基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠；N个亚探针的长度均为50‑150bp。利用本发明专利技术的DMD基因捕获探针对DMD基因进行检测不仅可以检测DMD基因是否存在缺失/重复扩增突变，还可以精确定位断裂点区域以及片段大小，还可以检测待测样本的DMD基因点突变。

【技术实现步骤摘要】
DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用
本专利技术涉及生物
中，DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用。
技术介绍
DMD基因是假肥大型肌营养不良综合征致病基因(DMD/BMD)，位于X染色体Xp21.2区域，是目前已知的最大的人类基因，含有79个外显子，基因突变概率较高，在新生儿男婴中达到约1:3500。DMD基因含有多种突变类型，单个或多个外显子缺失突变最为常见，约占60～70％，单个或多个外显子重复扩增突变，约占5～10％，点突变包括单个或数个核苷酸置换、缺失或插入等，约占DMD所有突变的25％～35％。DMD基因庞大，突变发生率高，突变类型多样，各种各样的突变加在一起据统计达到四、五千种之多，这就给临床上DMD基因检测带来了很大的困难。传统的DMD基因突变检测方法，对于不同的突变类型需要选择不同的检测技术，对于点突变，需要应用Sanger测序进行检测，对于外显子重复或缺失突变，需要应用微阵列比较基因组杂交技术(a-CGH)、MLPA或多重PCR等技术进行检测，上述检测策略和方法检测效率低，而且不能确定外显子缺失的精确位点与片段大小，因此，本领域需要能同时检测DMD多种突变类型的更准确和效率更高的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测DMD基因全基因的突变。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了DMD基因捕获探针。所用DMD基因的序列为人类参考基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。本专利技术所提供的DMD基因捕获探针，按照捕获探针的制备方法制备，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述DMD基因的全部序列。上述DMD基因捕获探针中，所述亚探针均可为单链DNA。上述DMD基因捕获探针中，在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针均可满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针具体均可满足上游亚探针的下游有3个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。上述DMD基因捕获探针中，所述N个亚探针的长度均可为50-150bp。所述N个亚探针的长度具体均可为60bp。所述N个亚探针可为38954个亚探针。上述DMD基因捕获探针中，所述N个亚探针的序列均可满足：第1条亚探针的序列为DMD基因的第1-60位；第2条亚探针的序列为DMD基因的第58-117位；第3条亚探针的序列为DMD基因的第115-174位；……第n条亚探针的序列为DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；……第38953条亚探针的序列为DMD基因的第2220265-2220324位；第38954条亚探针的序列为DMD基因的第2220322-2220381位；其中，n为1-38954中的任一个自然数。上述DMD基因捕获探针中，所述连接所述N个亚探针可包括下述A1)和A2)：A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到所述DMD基因捕获探针。所述制备方法在连接所述N个亚探针前还可包括对所述N个亚探针进行磷酸化修饰。对所述N个亚探针进行磷酸化修饰具体可为在所述N个亚探针的5′端进行磷酸化修饰。所述磷酸化修饰可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行所述磷酸化修饰的反应体系可为：所述N个亚探针10μl、10×反应缓冲液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反应体系中所述N个亚探针的浓度可为5ng/μl。所述反应体系中10×反应缓冲液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均为NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。所述磷酸化修饰的反应条件可为37℃30min。所述连接所述N个亚探针可利用ssDNA连接酶或epicentre的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)进行。所述连接的反应体系可为：所述N个亚探针的磷酸化产物或所述N个亚探针20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述连接的反应条件可为60℃60min。步骤A2)中，在进行将所述长链DNA或所述环状DNA进行扩增时还可包括利用生物素对扩增产物进行标记。进行所述扩增可采用随机引物进行。所述随机引物可为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物。所述随机引物中所有单链DNA的摩尔数均可相同。将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增以及利用生物素对扩增产物进行标记可利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应体系可为：所述长链DNA和/或所述环状DNA10μl、2×反应缓冲液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_Enzyme1μl和H2O9μl。其中，2×反应缓冲液中含有所述随机引物。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应温度可为37℃。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的时间可不小于16小时。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述N个亚探针。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了DMD基因突变检测系统。本专利技术所提供的DMD基因突变检测系统，包括所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针。上述系统可由所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针与检测基因突变所需的仪器和/或试剂组成。所述检测基因突变所需的试剂不包括所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针。所述检测基因突变所需的仪器和/或试剂可为构建全基因组文库所需的仪器和/或试剂，和/或，捕获DMD基因所需的仪器和/或试剂，和/或，进行测序所需的仪器和/或试剂。所述捕获DMD基因所需的仪器和/或仪器可为MyOne磁珠和/或迈基诺基因科技股份有限公司的缓冲液HY、2X结合缓冲溶液、WB1缓冲液、WB3缓冲液和/或稀释缓冲溶液。所述进行测序所需的仪器和/或试剂可为利用二代测序所需的仪器和/或试剂。所述二代测序可为利用Illumina测序平台或其他测序平台进行的测序，如IlluminaHiSeq2000、IlluminaHiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或XTen。所述系统可为仅包括相关试剂的试剂或试剂盒。所述系统也可为含有所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针的生物芯片。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述捕获探针的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了DMD基因突变检测方法。本专利技术所提供的DMD基因突变检测方法，包括利用所述DMD基因捕获探针捕获待测样本的DMD基因，然后对捕获的DMD基因进行测序，根据所述待测样本的测序结果确定所述待测样本的DMD基因的突变。上述DMD基因突变检测方法中，所述确定所述待测样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
DMD基因捕获探针，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述DMD基因的全部序列。

【技术特征摘要】
1.DMD基因捕获探针，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述DMD基因的全部序列。2.根据权利要求1所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。3.根据权利要求1或2所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为50-150bp。4.根据权利要求1-3中任一所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为60bp。5.根据权利要求1-4中任一所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的序列均满足：第1条亚探针的序列为DMD基因的第1-60位；第2条亚探针的序列为DMD基因的第58-117位；第3条亚探针的序列为DMD基因的第115-174位；……第n条亚探针的序列为DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；……第38953条亚探针的序列为DMD基因的第2220265-2220324位；第38954条亚探针的序列为DMD基因的第2220322-2220381位；其中，n为1-38954中的任一个自然数。6.权利要求1-5中任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，林朋，
申请(专利权)人：北京迈博恒业科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11