用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法，所述引物包括第一引物对和巢式PCR引物，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的PIC‑2L‑F和序列号为SEQ ID NO.7的PIC‑2L‑R。所述方法包括如下步骤：(1)提取待测样品的总基因组DNA；(2)将总基因组DNA采用第一引物对进行PCR扩增；(3)步骤(2)扩增后的产物采用巢式PCR引物进行二次扩增；(4)对步骤(3)二次扩增后的产物进行检测。本发明专利技术可准确、简便、快速获取星头啄木鸟ISCA1基因的长片段序列。

【技术实现步骤摘要】
用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法。
技术介绍
许多生物都有利用地磁场来导航或迁徙的现象，如候鸟的迁徙，信鸽传递信息等。早在1978年，SchuLten等提出的“自由基对理论”模型认为，磁受体很有可能来自一种名为隐花色素(Cryptochrome，Cry)的蓝光受体蛋白，这个过程涉及电子在磁场下的量子化学反应，并且需要视觉系统的参与。这个模型后来成为许多理论工作的雏形，由Ritz和Wiltschkos等人逐步完善，而Cry蛋白几十年来也一直是唯一的磁受体蛋白候选者。直到2015年6月，Vidal-Gadea等确定了秀丽隐杆线虫用于定位的磁敏神经元。Vidal-Gadea等认为，当线虫钻入土壤时，可根据地球的磁域进行定位，以至于来自世界不同地区的线虫种群，可根据自己的地理位置迁移到不同角度的土壤中。这说明，Cry蛋白可能并不是唯一的磁受体候选者。2015年11月，谢灿等鉴定出ISCA1(iron-suLfurclusterassembly1)基因是另一个磁感应受体蛋白基因，证明它编码的铁硫蛋白和隐花色素蛋白不仅在体外组成棒状复合物，在体内也是共定位的，这两种蛋白组成的复合物的晶体在体外会根据磁场的方向而改变自己的朝向。ISCA1基因编码一种铁硫蛋白，铁硫蛋白最早由美国科学家HelmutBeinert在1960年发现，并在其后得到了广泛研究，包括它们的蛋白质组装过程、生理学功能以及由于蛋白质异常产生的疾病等等，但是从来没有人把铁硫蛋白和生物感磁动物迁徙联系在一起。ISCA1作为编码磁感应受体蛋白的基因尚待进一步深入研究。鸟类是研究生物迁徙和导航的理想载体。据世界鸟类学家联合会(InternationalOrnithologists’Union)最新统计结果，世界现存鸟类10，660种，分属于40个目，238个科，2294个属。而目前已知的鸟类ISCA1基因的序列只有数十种，分散在各个目中，分子数据少，对于深入研究鸟类导航或迁徙的分子机制带来了很大的困难。星头啄木鸟(Yungipicuscanicapillus)，据世界鸟类学家联合会最新分类(IOC-6.4)属于鴷形目(Piciformes)、啄木鸟科(Picidae)、Yungipicus属，本专利技术基于利用巢式PCR技术，通过设计特异性引物组对星头啄木鸟ISCA1基因长片段进行扩增和测序，获得了星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1的长片段序列，为深入研究鸟类导航或迁徙的分子机制积累分子数据、夯实理论基础。本专利技术方法技术实用性强，重复性好，可以特异性扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1的长片段序列。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法，目的是利用特异性引物，快、准确的获得行头啄木鸟ISCA1基因序列。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物，所述引物包括第一引物对和巢式PCR引物，所述第一引物对包括序列号为SEQIDNO.1的PIC-2L-F和序列号为SEQIDNO.7的PIC-2L-R。优选的，所述巢式PCR引物包括第二引物对、第三引物对和第四引物对，所述第二引物对包括序列号为SEQIDNO.1的PIC-2L-F和序列号为SEQIDNO.2的PIC-PART2-1R；所述第三引物对包括序列号为SEQIDNO.3的PIC-PART2-2F和序列号为SEQIDNO.4的PIC-PART2-2R；所述第四引物对包括序列号为SEQIDNO.5的PIC-PART2-3F和序列号为SEQIDNO.6的PIC-PART2-3R。优选的，所述星头啄木鸟是采用鴷形目星头啄木鸟。一种扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测样品的总基因组DNA；(2)将总基因组DNA采用第一引物对进行PCR扩增；(3)步骤(2)扩增后的产物采用巢式PCR引物进行二次扩增；(4)对步骤(3)二次扩增后的产物进行检测。通过琼脂糖凝胶电泳图可以看出，对应PCR产物泳道均有条带。步骤(3)二次扩增后产物的条带中所含有的DNA片段的长度均在1kb-2kb之间。步骤(2)中所述PCR扩增是以12.5uL的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度为5μM/L，体积为0.5μL，模板的用量为1μL。步骤(2)中所述PCR扩增过程的退火温度均为55℃，退火时间为15s。步骤(3)中所述二次扩增是以12.5uL的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度为5μM/L，体积为1.1μL，模板的用量也为1μL。为了得到更好的扩增效果，步骤(3)中所述二次扩增过程的退火温度均为55℃，退火时间为30s。步骤(2)中以星头啄木鸟的总DNA为模板，进行PCR长片段扩增：采用12.5uL体系:ddH2O3.75uL，2×Universebuffer6.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)0.25uL，Template1uL，PIC-2L-F(5umol/L)0.5uL，PIC-2L-R(5umol/L)0.5uL，UniverseHigh-FidelityHotStartDNApolymerase(1U/uL)0.25uL。PCR反应体系为：95℃预变性3min。然后进行35个循环，该循环包括95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min7s。最后72℃延伸5min。步骤(3)中二次扩增以步骤(2)PCR扩增后产物为模板，进行PCR短片段扩增：采用12.5uL体系:ddH2O6.985uL，10×Ex-taqbuffer1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，primer-F(5umol/L)1.1uL，primer-R(5umol/L)1.1uL，Ex-taq(5U/uL)0.065uL。PCR反应体系为：95℃预变性3min。然后进行36个循环，该循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s。最后72℃延伸10min。本专利技术有益效果是:本专利技术通过设计四组特异性PCR引物，利用巢式PCR扩增的方法，对待测样品通过两次PCR扩增，可准确、简便、快速获取星头啄木鸟ISCA1基因的长片段序列。使用琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增效果。所用的模板可从动物肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度。总之，本专利技术达到了简便易行，经济实用的目的。附图说明下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：图1是本专利技术的巢式PCR扩增的产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1-24均来自星头啄木鸟肌肉样品，泳道M为分子量标记。具体实施方式下面通过对实施例的描述，对本专利技术作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。需要阐明的是，所述引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成且引物浓度为5umol，本专利技术中使用的Ex-taq、dNTPMix为Takara公司的市售品，热启动酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物，其特征在于，所述引物包括第一引物对和巢式PCR引物，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的PIC‑2L‑F和序列号为SEQ ID NO.7的PIC‑2L‑R。

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物，其特征在于，所述引物包括第一引物对和巢式PCR引物，所述第一引物对包括序列号为SEQIDNO.1的PIC-2L-F和序列号为SEQIDNO.7的PIC-2L-R。2.根据权利要求1所述用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物，其特征在于，所述巢式PCR引物包括第二引物对、第三引物对和第四引物对，所述第二引物对包括序列号为SEQIDNO.1的PIC-2L-F和序列号为SEQIDNO.2的PIC-PART2-1R；所述第三引物对包括序列号为SEQIDNO.3的PIC-PART2-2F和序列号为SEQIDNO.4的PIC-PART2-2R；所述第四引物对包括序列号为SEQIDNO.5的PIC-PART2-3F和序列号为SEQIDNO.6的PIC-PART2-3R。3.根据权利要求1或2所述用于扩增星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段的引物，其特征在于，所述星头啄木鸟是采用鴷形目星头啄木鸟。4.采用权利要求1或2所述引物在星头啄木鸟磁感应受体蛋白基因ISCA1片段测序中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：阚显照，章勤，丁恒武，王莹，蒋澜，王青青，吴璇，陈仁瑞，易双龙，宛凤英，王会梅，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34