一种新琼四糖的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了属于琼胶寡糖制备技术领域的一种新琼四糖的制备方法及其应用。该方法采用β‑琼胶酶AgWH50B酶液和β‑琼胶酶AgOGA118酶液联合酶解，得到新琼四糖纯品。本发明专利技术利用β‑琼胶酶AgWH50B和β‑琼胶酶AgOGA118的协同酶解作用，水解琼脂糖制备新琼四糖，酶解效率好、产物纯度高。本发明专利技术可实现高纯度新琼四糖的高效制备，且制备的新琼四糖具有很好的肠道菌群调节能力，为以新琼四糖为原料开发功能性食品和保健品提供了理论和技术支持，具有良好的应用潜力和前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新琼四糖的制备方法及其应用
本专利技术属于琼胶寡糖制备
，具体涉及一种酶解琼脂糖制备新琼四糖的方法及其在肠道微生态调节方面的应用。
技术介绍
新琼寡糖是由琼脂糖(一种线性多糖，主要来源于江蓠、石花菜、紫菜等红藻的细胞壁)降解而得，一般由2-10个单糖组成，以D-半乳糖为还原性末端，具有多种生理活性。新琼寡糖的制备方法主要有酸解法和酶解法两种，其中酸解法的应用较多，但酸解法存在污染环境、产物复杂和反应剧烈的缺点，制约了这种方法的大规模应用。酶解法具有酶解过程温和、环境友好和产物纯度较高等优点，为新琼寡糖的制备开辟了新的方向。虽然与酸解法相比酶解法具有诸多优点，但作为被酶解的底物，琼脂糖分子量大、碳链长度长、溶液黏度高，一定程度上限制了酶与底物的接触速率，进而影响酶解过程的效率。因此，如何提高琼脂糖的酶解效率是酶解法制备新琼寡糖的关键技术。同时，新琼寡糖的生理活性与其聚合度有很大相关性，现有的报道都集中于新琼寡糖混糖的制备和生理活性研究，缺乏单一聚合度新琼寡糖的制备和功能活性研究。如何制备高纯度的单一聚合度新琼寡糖，并研究其生理活性，对于新琼寡糖的开发应用具有重要的理论价值和推动作用。、专利CN201410148086公开了一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶，该β-琼胶酶为AgWH50B，该β-琼胶酶单独转化作用时间较长，转化率低，制备的产品纯度不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶解法高效制备新琼四糖的方法及新琼四糖的应用，从而弥补现有技术的不足。一种新琼四糖的制备方法，按照如下步骤进行：(1)配置质量分数为0.3-0.7％的琼脂糖溶液；(2)按重量比(0.2-1):100分别加入β-琼胶酶AgWH50B酶液和β-琼胶酶AgOGA118酶液，35-45℃温育6-10h，得到酶解液；(3)将酶解液于55-65℃减压浓缩，加入2-5倍体积无水乙醇，于8000-10000rpm，0-8℃低温离心10-20min，收集上清；(4)于55-65℃减压浓缩上清，上清经0.35-0.55μm膜过滤后，过分子筛纯化，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。步骤(1)中采用pH7.0的缓冲液配置琼脂糖溶液。所述分子筛为Bio-GelP2柱。步骤(4)过分子筛纯化后，经过TLC(薄层色谱)检测，纯度达到90％再进行冷冻干燥纯化。上述制备的新琼四糖在恢复哺乳动物肠道菌群结构及肠道有益菌增殖方面的应用。进一步的，所述新琼四糖在恢复哺乳动物肠道菌群结构及肠道有益菌增殖方面的应用，其所述新琼四糖促进肠道中双歧杆菌，乳杆菌，厚壁菌和拟杆菌的增殖。进一步的，所述新琼四糖在恢复哺乳动物肠道菌群结构及肠道有益菌增殖方面的应用，其所述新琼四糖可改善小鼠肠道菌群结构。本专利技术的有益效果：本专利技术利用β-琼胶酶AgWH50B和β-琼胶酶AgOGA118的协同酶解作用，水解琼脂糖制备新琼四糖，酶解效率好、产物纯度高。同时，通过小鼠肠道微生态调节作用研究发现，与新琼混糖相比，新琼四糖的肠道微生物调节和恢复能力最强。本专利技术可实现高纯度新琼四糖的高效制备，且制备的新琼四糖具有很好的肠道菌群调节能力，为以新琼四糖为原料开发功能性食品和保健品提供了理论和技术支持，具有良好的应用潜力和前景。附图说明图1酶解产物新琼四糖的TLC分析。图2各实验组小鼠粪便总菌数量图。图3各实验组小鼠粪便双歧杆菌数量图。图4各实验组小鼠粪便乳杆菌数量图。图5各实验组小鼠粪便厚壁菌数量图。图6各实验组小鼠粪便拟杆菌数量图。图7小鼠肠道菌群DGGE电泳图。图8DGGE电泳图谱虚拟图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例利用两种β-琼胶酶协同催化琼脂糖制备新琼四糖，并对新琼四糖纯品的肠道菌群调节作用进行了评价。实施例中使用的β-琼胶酶AgWH50B和β-琼胶酶AgOGA118基因可以从淡黄色噬琼胶菌WH0801(NRRLB-59247(T)或CGMCC1.10131(T))中克隆得到，也可以根据编码两种酶基因的核酸序列通过基因合成获得。实施例1：AgWH50B酶液的制备根据AgWH50B序列使用引物5’-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3’和5’-CGAGCTCTTTTTTTTGTAACGCAG-3’，以淡黄色噬琼胶菌WH0801为模板进行PCR扩增，将扩增得到的AgWH50B基因连接至pET21a载体，构建AgWH50B表达载体pET50B。将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌PET50B/BL21。将重组大肠杆菌在5052自诱导培养基中20℃培养36h，培养完毕离心收集菌体。利用pH7.0缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心取上清，得到AgWH50B酶液。实施例2：AgOGA118酶液的制备根据AgOGA118序列使用引物5’-CGGAATTCATGTTAAAGCGCCACC-3’和5’-CCCTCGAGTTGGCAAGTATAACCTGAC-3’，以淡黄色噬琼胶菌WH0801为模板进行PCR扩增，将扩增得到的AgOGA118基因连接至pET21a载体，构建AgOGA118表达载体pET118。将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌PET118/BL21。将重组大肠杆菌在5052自诱导培养基中20℃培养36h，培养完毕离心收集菌体。利用pH7.0缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心取上清，得到AgOGA118酶液。实施例3：AgWH50B酶解琼脂糖使用pH7.0的缓冲液配置0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，混合均匀后于40℃温育8h进行酶解反应。酶解结束后将酶解液于60℃减压浓缩，浓缩液加入3倍体积无水乙醇，于9000rpm，4℃低温离心15min，收集上清。于60℃减压浓缩上清，上清经0.45μm膜过滤后，过Bio-GelP2柱纯化，TLC检测，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。经计算所得新琼四糖纯度为96％，底物转化率为52％。实施例4：AgWH50B酶解琼脂糖使用pH7.0的缓冲液配置0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，按重量比1:1000加入黑曜石粉末，混合均匀后于40℃温育8h进行酶解反应。酶解结束后将酶解液于60℃减压浓缩，浓缩液加入3倍体积无水乙醇，于9000rpm，4℃低温离心15min，收集上清。于60℃减压浓缩上清，上清经0.45μm膜过滤后，过Bio-GelP2柱纯化，TLC检测，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。经计算所得新琼四糖纯度为97％，底物转化率为88％。实施例5：AgWH50B酶解琼脂糖使用pH7.0的缓冲液配置0.5％的琼脂糖溶液，按重量比1:100加入AgWH50B酶液，混合均匀后于40℃温育24h进行酶解反应。酶解结束后将酶解液于60℃减压浓缩，浓缩液加入3倍体积无水乙醇，于9000rpm，4℃低温离心15min，收集上清。于60℃减压浓缩上清，上清经0.45μm膜过滤后，过Bio-GelP2柱纯化，TLC检测，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。经计算所得新琼四糖纯度为96％，底物转化率为71％。实施例6：AgWH50B酶解琼脂糖使用pH7.0的缓冲液配置0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新琼四糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)配置质量分数为0.3‑0.7％的琼脂糖溶液；(2)按重量比(0.2‑1):100分别加入β‑琼胶酶AgWH50B酶液和β‑琼胶酶AgOGA118酶液，35‑45℃温育6‑10h，得到酶解液；(3)将酶解液于55‑65℃减压浓缩，加入2‑5倍体积无水乙醇，于8000‑10000rpm，0‑8℃低温离心10‑20min，收集上清；(4)于55‑65℃减压浓缩上清，上清经0.35‑0.55μm膜过滤后，过分子筛纯化，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。

【技术特征摘要】
1.一种新琼四糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)配置质量分数为0.3-0.7％的琼脂糖溶液；(2)按重量比(0.2-1):100分别加入β-琼胶酶AgWH50B酶液和β-琼胶酶AgOGA118酶液，35-45℃温育6-10h，得到酶解液；(3)将酶解液于55-65℃减压浓缩，加入2-5倍体积无水乙醇，于8000-10000rpm，0-8℃低温离心10-20min，收集上清；(4)于55-65℃减压浓缩上清，上清经0.35-0.55μm膜过滤后，过分子筛纯化，冷冻干燥纯化后样品，得到新琼四糖纯品。2.根据权利要求1所述一种新琼四糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用pH7.0的缓冲液配...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，孙建安，唐庆娟，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37