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一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法技术

技术编号:15629278 阅读:17 留言:0更新日期:2017-06-14 13:26
本发明专利技术涉及一种获得高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法,属于植物基因工程和生物技术领域;本发明专利技术首先采用农杆菌浸花法将激活标签载体pCB260转化到油菜中;对转化植株种子利用绿色荧光蛋白GFP筛选;并采用草丁膦除草剂筛剂筛选油菜转化株;最后采用PCR方法鉴定转化植株;对转化植株的表型分析发现,最终得到少分枝油菜突变体,记为

【技术实现步骤摘要】
一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法
本专利技术涉及一种获得高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法,属于植物基因工程和生物

技术介绍
油菜(Brassicanapus)属于十字花科,是我国第五大农作物仅次于水稻、小麦、玉米和大豆。我国是植物油消费大国,国内菜籽油产量仅能满足人们消费需求的2/3,大量油料消耗依赖进口。另外油菜作为生物柴油原料作物,被越来越多的国家所重视,有望成为解决化石能源危机的重要替代物,因此提高油菜的产量对我国具有重要的战略性意义。近年来我国社会发展迅速,乡村劳动力减少,劳动力价格上涨,种植油菜的成本提高,种植面积日益减少。另一方面,我国油菜生产方式传统,机械化水平远不如小麦、水稻和玉米等作物,需要大量劳动力,从而导致我国油菜生产效率低,国际竞争力较弱。因此,进一步增强油菜生产的机械化水平,降低生产成本,提高农民种植积极性,是我国需要解决的首要问题。从育种角度出发,培育优良的适合高密种植及机械化收获的油菜品种,根本解决油菜收获机械化问题,成为育种家首要目标之一。油菜分枝在植株生长过程中不仅在植株地上形态形成中起着重要作用,而且可通过影响单株结实量进一步影响到油菜总产量,因此在油菜生产中具有举足轻重的地位。我国油菜品种主要特征有分枝较多、茎杆粗壮、株型较大、角果分散且易裂,导致机械收割困难大效率低,另外单株角果成熟时期不同,各部位角果之间成熟期差异较大,未成熟角果脱粒难而导致油菜收获损失率高达10%~15%,迫切需要选育优良的油菜品种来提高油菜收获得机械化水平。发现并培育株型紧凑、分枝高度增高、花期集中、结荚层集中等新型油菜品种以适应密植及机械化收获是国内外油菜品种改良的发展趋势。傅廷栋等(申请号CN200810048092.5)专利技术公开了一种适应高密度种植和机械化收获得新型矮秆紧凑型油菜选育及鉴定方法,该方法通过不同油菜品种杂交得到的F1代植株,将F1代植株花蕾用秋水仙碱加倍染色体,小孢子培养获得双单倍体分离群体。然后对分离群体进行多年田间观察、表型筛选得到该适合机械化收获的矮秆紧凑型油菜品种。该方法属于植物育种领域,获得油菜品种时间漫长、工作量大、表型差异不明显。目前,本专利技术获得一种初级分枝高度增高、分枝集中于顶部、结荚层集中的突变体植株,暂定名为sfz(少分枝)。
技术实现思路
本专利技术为克服现有技术中存在的技术缺陷,目的在于提供一种适合于油菜高密度种植和机械化收获材料的获得方法。利用该方法获得的适应高密度种植、机械化收获的油菜品种可有效解决当前油菜生产中面临的收获损失率高、种植成本高的问题。本专利技术还公开了含有4个重复串联CaMV35S增强子序列的激活标签载体PCB260(关艳龙等,激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析,云南植物研究,2010)在转化获得油菜突变体株中的应用。本专利技术所述的一种适于高密度种植和机械化收获的油菜材料的获得方法,具体操作如下:(1)采用农杆菌浸花法将激活标签载体转化到油菜中:将激活标签载体转化到农杆菌感受态细胞中,将鉴定转化成功的菌制备菌悬液;将目标物油菜植株上已开花的花蕾和角果减掉,然后进行浸花过程。其中所述的激活标签载体为pCB260;所述的农杆菌感受态细胞为GV3101;所述浸花过程如下:(1)第一次浸花:除去开放的花蕾,把整个未开放花蕾浸润于含有重组质粒pCB260的农杆菌菌液里5分钟,浸花中轻柔地晃动菌液,利于提高转化率;浸润完毕的花蕾套入羊皮袋内。(2)第二次浸花:距离第一次浸花后1-2天,重复步骤(1),此步无需去除开放的花蕾。(3)第三次浸花:距离第二次浸花后1-2天,重复步骤(2)。(4)浸花后管理:浸花结束后,待植株授粉完毕,去掉羊皮纸袋,不定时剪掉新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序其顶端新萌发的花蕾,直接用水浇灌培养植株,直至收获。注:每次浸花前都要按上述方法重新摇含有pCB260质粒的农杆菌菌液,保证菌液OD值为2,新鲜菌液生长活力强有利于提高转化效率。(2)利用绿色荧光蛋白GFP筛选油菜转化株:(3)采用草丁膦除草剂筛剂筛选油菜转化株;(4)PCR方法鉴定转化植株:将筛选得到的含有激活标签载体pCB260的油菜突变体植株叶片作为实验材料,CTAB法小量提取基因组DNA,PCR扩增激活标签载体PCB260上的bar片段。PCR引物:Bar-R:5’-CACCATCGTCAACCACTACATC-3’Bar-F:5’-ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’PCR程序:95℃,5min,预变性;95℃,1min;56℃,50s;72℃,30s;32个循环;72℃,5min,延伸。(5)转化植株的表型分析:在大量转化株中,发现了少分枝油菜突变体,记为sfz,且该植株在F2代生长中符合孟德尔遗传定律,对其进行表型分析,与野生型宁油12植株相比,幼苗期突变体sfz叶片表面发亮,成熟期突变体sfz的分枝较少,有效分枝高度增高,并且角果集中在植株顶端。针对成熟期少分枝油菜突变体及宁油12野生型植株20株植株一级分枝数进行统计,少分枝突变体一级分枝数略少于野生型植株,分枝较集中且无效分枝减少。针对收获期少分枝油菜突变体sfz20株植株的有效分枝高度进行统计,发现少分枝突变体的有效分枝高度平均高于野生型宁油12约20cm而植株高度与宁油12无明显差异,少分枝突变体分枝均集中于植株顶部。本专利技术的优点:1.本专利技术中所采用的农杆菌介导的体外浸蘸渗透法转化油菜,速度快、成本低、操作简单。2.本专利技术中所采用的激活标签载体pCB260含有4个重复串联CaMV35S增强子序列,插入到油菜基因组中,插入位点附近的基因会被激活而得到过量表达,被激活的基因与T-DNA紧密联系易于分离出该基因。3.应用激活标签载体pCB260获得的过表达植株为显性突变体,突变体表型在T1即可直接观察到,因而极大的弥补了传统方法构建的隐形突变体的不足。4.本专利技术利用basta和绿色荧光蛋白GFP高效初步筛选转化株,进一步提取植株嫩叶基因组DNA进行PCR鉴定,最终确定转化株,省时高效,成本低,容易操作。5.本专利技术利用激活标签载体pCB260转化油菜后所获得的有效分枝高度增高,分枝集中于顶部的少分枝油菜突变体sfz,为机械化大规模生产研究提供了新材料,具有重要应用前景。6.少分枝油菜突变体sfz为功能获得型突变体,为研究植物分枝发育调控机制提供了极佳的研究材料。附图说明图1:含有4个重复串联CaMV35S增强子序列的激活标签载体PCB260。图2:利用绿色荧光蛋白GFP初筛油菜突变体种子;其中,A:带有胚轴的种子绿色荧光筛选合成图,B:带有胚轴的种子绿色荧光筛选图图3:草丁膦除草剂筛剂初筛油菜突变体植株过程图;其中A:未喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株,B:第一次喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株,C:第二次喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株。图4:油菜突变体植株PCR鉴定;其中,M:DL2000DNAMarker;1-12:突变体植株;—:阴性对照基因组DNA;+:阳性对照。图5:少分枝油菜突变体sfz幼苗期叶片表面发亮表型。图6:少分枝油菜突变体sfz开花期植株和野生型植株宁油12对比图。图7:少分枝油菜突变体sfz成熟植株一级分枝本文档来自技高网
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一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法

【技术保护点】
一种适于高密度种植和机械化收获的油菜材料的获得方法,其特征在于,具体操作如下:(1)采用农杆菌浸花法将激活标签载体转化到油菜中:将激活标签载体转化到农杆菌感受态细胞中,将鉴定转化成功的菌制备菌悬液;将目标物油菜植株上已开花的花蕾和角果减掉,然后进行浸花过程;(2)利用绿色荧光蛋白GFP筛选油菜转化株:(3)采用草丁膦除草剂筛剂筛选油菜转化株;(4)PCR方法鉴定突变体植株:将筛选得到的含有激活标签载体pCB260的油菜突变体植株叶片作为实验材料,CTAB法小量提取基因组DNA,PCR扩增激活标签载体pCB260上的bar片段;(5)转化植株的表型分析,确定得到的转化植株为适于高密度种植和机械化收获的油菜材料。

【技术特征摘要】
1.一种适于高密度种植和机械化收获的油菜材料的获得方法,其特征在于,具体操作如下:(1)采用农杆菌浸花法将激活标签载体转化到油菜中:将激活标签载体转化到农杆菌感受态细胞中,将鉴定转化成功的菌制备菌悬液;将目标物油菜植株上已开花的花蕾和角果减掉,然后进行浸花过程;(2)利用绿色荧光蛋白GFP筛选油菜转化株:(3)采用草丁膦除草剂筛剂筛选油菜转化株;(4)PCR方法鉴定突变体植株:将筛选得到的含有激活标签载体pCB260的油菜突变体植株叶片作为实验材料,CTAB法小量提取基因组DNA,PCR扩增激活标签载体pCB260上的bar片段;(5)转化植株的表型分析,确定得到的转化植株为适于高密度种植和机械化收获的油菜材料。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述激活标签载体为pCB260;所述的农杆菌感受态细胞为GV3101。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述浸花具体操作过程如下:(1)第一次浸花:除去开放的花蕾,把整个未开放花蕾浸润于含有重组质粒pCB...

【专利技术属性】
技术研发人员:谭小力付正莉黄琪朱克明王政丁丽娜曹军张志燕陈克平
申请(专利权)人:江苏大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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