利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性。分离得到一种能够提高拟南芥DON耐受能力和赤霉病抗性的基因TaMetRS。通过筛选小麦悬浮细胞抑制差减杂交cDNA文库及RACE克隆基因全长的方法，从小麦品种中分离得到一个受DON诱导的基因TaMetRS。利用农杆菌介导的遗传转化方法，使该基因在拟南芥中超量表达，提高了转基因拟南芥对DON耐受能力和对赤霉病的抗性，研究证实了该基因作为植物抗赤霉病功能的新用途。该基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中1-2186位碱基对应的序列，编码596个氨基酸。该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术实现步骤摘要】
利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性
本专利技术属于小麦转基因
具体涉及利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性。所述的基因分离克隆自TaMetRS基因，该基因被证实是一种具有新功能的MetRS基因，在植物的防御反应和脱毒过程中起着重要的作用。TaMetRS基因受到DON的诱导，定位于细胞核，参与细胞防御反应的调控。超表达该基因可以提高拟南芥对DON的耐受性及FHB的抗性。利用本专利技术的基因，可望提高植物的赤霉病抗性，为转基因小麦抗病育种提供新的安全的基因资源。
技术介绍
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦赤霉病(Fusariumheadblight，FHB)是由禾谷镰刀菌为主引起的真菌性病害，主要发生在世界温暖潮湿和半潮湿地区，在我国主要发生在长江中下游地区，严重降低小麦产量和品质，威胁粮食安全。禾谷镰刀菌可以在苗期和花期侵染小麦引起苗腐病和穗腐病，并产生包括单端孢霉烯，玉米烯酮和伏马菌素等多种真菌毒素。作为单端孢霉烯类毒素中分布最广的deoxynivalenol(DON)毒素，已经成为世界范围内粮食及饲料的主要污染源之一。DON毒素能够抑制真核细胞蛋白质的生物合成，人或动物在食用含有DON毒素的食品后，会导致强烈的呕吐并破坏免疫系统，严重影响人和牲畜的健康。MetRS基因的基本传统功能是催化甲硫氨酸(methionion)与相对应的tRNA的连接，形成Met-tRNAiMet，在蛋白的生物合成过程中起着至关重要的作用。但是同时MetRS在也具有其它重要的作用。MetRS可能在rRNA的生物合成中起着重要的作用，在哺乳动物中MetRS具有抑制癌细胞的活性，同时MetRS是人类非洲锥虫病抗寄生虫药物的靶标。但是到至今为止，还没有MetRS基因与DON抗性和FHB抗性有关的相关报道。在申请人的前期研究中，从小麦悬浮细胞的抑制差减杂交文库(suppressionsubtractivehybridization，SSH)中筛选到一个390bp的EST片段，受到DON的强烈的诱导，后来通过3’RACE和5’RACE克隆到了基因的全长，将该基因命名为TaMetRS。鉴于在小麦中的TaMetRS基因能否提高植物的FHB抗性尚无报道，因此，从小麦中分离到TaMetRS基因，并鉴定它具有新的功能，在拟南芥中超表达该基因后，能够提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性，对于培育小麦抗病新品种具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的涉及一个小麦的TaMetRS基因在控制植物赤霉病抗性改良中的应用。本专利技术分离和应用一种包含TaMetRS基因的DNA片段，该片段赋予拟南芥幼苗DON的抗性及花期FHB的抗性。其中所述的TaMetRS基因的核苷酸序列如列表SEQIDNO：1所示，序列长度为2186bp，其中该基因的编码区是SEQIDNO：1中70-1860位碱基对应的序列，该基因编码的蛋白质序列如列表SEQIDNO：2所示，编码596个氨基酸。具体地，本专利技术的技术方案如下所述：一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1中1-2186位碱基对应的序列。一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，该基因编码的蛋白质的序列如序列表SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的应用的植物是拟南芥。本专利技术的应用包括下列步骤：利用PCR扩增小麦基因TaMetRS的编码区域，并在两端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点，连接到中间载体PTRAkc-VDM1-ERH中，得到植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化拟南芥，获得TaMetRS基因超量表达的转基因拟南芥，通过喷雾接种禾谷镰刀菌5035的孢子液，验证了转基因拟南芥的抗赤霉病能力。其中，所述的植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS包含有SEQIDNO：1中70-1860位碱基对应的序列编码区域。本专利技术中的培养基组分及配比如下所示：农杆菌培养基(YEB)：营养肉汤5g+酵母提取物5g+蛋白胨5g+蔗糖5g，(15g/L琼脂)pH7.0；1/2MS筛选培养基：MS大量(20×)25mL+MS有机(200×)5mL+MS铁盐(200×)2.5mL+MS微量(200×)2.5mL+100mg/L肌醇+20g/L蔗糖+50mg/LKana，(6.3g/L琼脂)pH5.8。上述培养基在添加完各组分后，补加蒸馏水定容至1L，在121℃高压蒸汽下灭菌18分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却到60℃的高压灭菌后的培养基中使用。本专利技术的优点在于：本专利技术克隆的TaMetRS基因可以提高拟南芥植株对真菌毒素DON的耐受性，并且显著提高了转基因拟南芥植株对赤霉病病原菌禾谷镰刀菌的抗性。本专利技术所使用的植物超表达载体pTRAkc-35SS-TaMetRS能够在拟南芥中高效表达TaMetRS基因，使提高植物的赤霉病抗性成为可能。下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。附图说明序列表SEQIDNO：1是本专利技术克隆的小麦基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)的核苷酸序列，序列长度为2186bp，它对应的氨基酸序列(即编码区)是SEQIDNO：1中70-1860位碱基对应的序列，编码596个氨基酸。序列表SEQIDNO：2是本专利技术的小麦基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)编码的的蛋白质序列。序列表SEQIDNO：3是从小麦的悬浮细胞的抑制差减杂交文库(SSH)中筛选得到390bp的EST片段的核苷酸序列。图1：是本专利技术分离克隆TaMetRS基因及功能鉴定的总体技术路线图。图2：TaMetRS基因的全长序列克隆。附图标记说明：图2中的A图为3’RACE产物；图2中的B图为5’RACE产物，图2中的C图为TaMetRS基因的全长cDNA。图3.TaMetRS基因在郑麦9023(Z9)和苏麦3号(S3)两个小麦品种中，接种DON，禾谷镰刀菌5035和Tri5－孢子液后的表达模式。图3中的A图为小麦品种Z9和S3接种DON毒素后TaMetRS基因的表达模式；图3中的B图为小麦品种Z9和S3接种不同的禾谷镰刀菌菌株5035和Tri5－后的表达模式。图3表明本专利技术的TaMetRS基因能被DON和产毒菌株禾谷镰刀菌5035诱导表达，而Tri5基因缺失的菌株Tri5－对TaMetRS基因的表达没有影响。图4：中间载体PTRAkc-VDM1-ERH的结构图谱。图5：本专利技术构建的植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS的结构图谱。图6：转基因拟南芥的分子鉴定及表达量分析。。附图标记说明：图6中的A图为转基因拟南芥的PCR鉴定，引物为TaMetRS-F2/TaMetRS-R2，目的产物大小为1800bp；图6中的B图为转基因拟南芥中TaMetRS基因的表达量分析，扩展TaMetRS基因的引物为TaMetRS-F3/TaMetRS-R3，目的片段大小为bp；内参基因Actin的扩增引物为Ac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO：1中1‑2186位碱基对应的序列。

【技术特征摘要】
1.一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列是序列表SEQIDNO：1中1-2186位碱基对应的序列。2.一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQIDNO：2所示。3.权利要求1或2所述的应用，其中所述的植物是拟南芥。4.权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤：利用PCR扩增小麦基因TaM...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，左东云，李和平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42