本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全基因的引物组及方法。所述引物组包括22个引物对，各引物对上下游引物依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.44所示。所述方法为提取PEDV总RNA，反转成cDNA，用所述引物组进行PCR扩增反应，将PCR产物连接克隆载体，选取阳性克隆，DNA测序鉴定，最后拼接序列，得到PEDV全基因组序列。本发明专利技术通过设计22对引物组对PEDV进行全覆盖式地扩增，将庞大的基因组细分为多段，可便于定点研究特定区段的核苷酸变化，包括位点突变、核苷酸插入与缺失等，以更好把握PEDV基因的变化动态，了解毒株的变化，为解决该病提供准确的分子信息。
【技术实现步骤摘要】
一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全基因组的引物组及方法
本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全的基因组的引物组及方法。
技术介绍
猪流行性腹泻的病原为猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，其主要诱发猪只肠道疾病，其症状表现为呕吐、腹泻，食欲下降，脱水，且具有显著的日龄依赖现象。特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％。2010年底，我国养猪场大范围爆发了PED，且近年来仍未得到有效控制对我国养猪业造成了巨大的损失。2013年4月美洲国家陆续爆发PED疫情，随后亚洲其他国家和部分欧洲国家也相继爆发PEDV疫情，再次给世界范围内的养猪业带来了巨大的危害。基于近年流行野毒株的出现及大流行，传统商品疫苗已经对变异毒株缺乏产生充分的抵抗作用。由此，对新流行的PEDV变异株的研究及分析其分子流行病学，可为揭示新发PEDV感染致病的分子机制和特异性诊断的研制提供必要的理论参考依据。猪流行性腹泻病毒在组成结构上为具有囊膜，且囊膜上有花瓣样纤突，核酸类型为线性，单股正链，不分节段的RNA病毒。在所有RNA病毒中，冠状病毒的基因组长度都相对较长。而PEDV完整的基因组核苷酸约有28,038nt，其基因组序列类似于mRNA一样，5’端具有帽子结构，3’端拥有Poly(A)尾巴。从5’端到3’端，基因结构顺序依次为5’UTR-Replicase(ORF1a/b)-S-ORF3-E-M-N-3’UTR；主要编码的结构蛋白有纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、包膜蛋白(Envelope，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)。而非结构蛋白有复制酶多聚蛋白(OpenReadingFrame1，ORF1a/b)和ORF3蛋白(OpenReadingFrame3，ORF3)。PEDV基因组5′端非翻译区(5′UTR)长296nt，包含一个长约65nt-98nt前导序列(L)，Kozak序列(GUUCAUGC)和一个短小的开放阅读框(ORF)。3′UTR长度约为334nt，拥有一个所有冠状病毒都有，但位置不同的保守8碱基(GGAAGAGC)序列。PEDV的复制酶多聚蛋白ORF1a/b(pp1ab)由两个亚单位蛋白ORF1a和ORF1b共同组成。在核苷酸序列中，ORF1a/b全长约20345nt，由包含46nt重叠序列的且长度分别为12354nt和8037nt的两个大阅读框组成，占据基因组约2/3的核苷酸数量。ORF1a/b非结构蛋白在病毒感染早期可执行多种重要的生物学功能，其中ORF1a主要执行蛋白切割作用及参与RNA的复制等，而ORF1b主要编码RNA依赖性RNA聚合酶。冠状病毒的纤突蛋白S共同拥有的包括附着于靶细胞，介导囊膜与细胞膜融合等的基本生物学功能。经典毒株CV777(AF353511)的S蛋白由约4152nt编码的1383个氨基酸组成。S蛋白属于1型的膜糖蛋白，从N到C端，分别是信号肽区(1-24aa)、长的细胞外区(25-1333aa)、(1334-1356aa)和较短的细胞质尾部(1357-1383aa)。同时根据其它冠状病毒S蛋白的同源性，还可将S蛋白分为通过折叠锚定的纤突亚蛋白S1(l-789aa)和S2(790-1383aa)。其中S1蛋白还可以再细分为具有结合受体的功能区域S1-NTD(N-terminaldomain，19-252aa)和S1-CTD(C-terminaldomain，509-638aa)。到目前为止，研究人员在S蛋白上鉴定出1个诱导中和抗体产的区域COE(99–638aa)和3个诱导中和抗体产生的表位，分别是SS2(748YSNIGVCK755)，SS6(764LQDGQVKI771)；2C10，1368GPRLQPY1374。研究表明，PEDV在细胞内的繁殖需要蛋白水解酶的协助，并且该过程可能涉及S蛋白。当病毒附着于宿主细胞的细胞膜之后，在外源的胰蛋白酶作用下，S蛋白被酶解断裂为两个亚基(S1和S2)，使被侵染的细胞发生更明显的病变。此外，S蛋白与体外培养病毒适应能力以及病毒滴度的衰减有关系。ORF3是PEDV惟一辅助基因，其完整的ORF3基因有675nt编码225aa。而在体外细胞传代过程中，ORF3核苷酸可以出现不同样式的缺失，充分表现了其多样性，与病毒毒力有关。在经典疫苗CV777和韩国DR13疫苗毒株中，ORF3基因出现了的49nt的缺失可以作为PCR诊断中，区分PEDV野毒与细胞致弱毒株的基因标记。2012年，Wang等首次发现ORF3蛋白和SARS-CoV的3a蛋白一样，能够在细胞表面形成钾离子通道，提高病毒的滴度。PEDV的E基因由231nt组成，编码76个氨基酸。该蛋白在病毒包膜和病毒粒子的组成等方面起着关键的作用。然而，在DR13致弱毒株中，存在21nt的缺失，E基因在PEDV的致病性和结构作用上仍有待研究。研究发现，E蛋白可以定位于内质网和核仁表面，引起内质网应激效应，不能影响肠道细胞IEC的细胞复制周期，但是可以上调白介素8和细胞凋亡Bcl-2的表达。M基因全长681nt，在目前研究中，其不存碱基的缺失，序列保守性仅次于N基因。M蛋白作为PEDV主要的囊膜结构蛋白，其在病毒粒子的装配和出芽过程发挥着重要作用。Laude,H.在其研究中发现，TGEV在细胞感染中，可以激发机体产生α-干扰素(IFN-α)。M蛋白还可以刺激机体产生中和抗体。除此之外，张志榜等还鉴定了M基因的线性表位195WAFYVR200，且该表位不能被TGEV阳性血清识别。PEDVN基因由1326nt组成，编码441个氨基酸。在PEDV基因组中，在核苷酸数量和种类上，保守性最高。N蛋白作为一种RNA结合蛋白，能与感染细胞中细胞核磷蛋白共定位于细胞核，根据吕茂杰报道，其发现N基因核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供了依据。因其富含碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸残基等而表现出高度的碱性，在pH＝9.0的低渗非离子溶剂中有最大的溶解度。在冠状病毒已知结构蛋白中，只有N蛋白是磷酸化的蛋白。丝氨酸残基被认为是潜在的磷酸化位点，PEDVCH/S毒株的N蛋白总共拥有35个丝氨酸残基，约占其总氨基酸残基数的7.9％，且主要集中在两个碱性区域内(57-190aa和199-391aa)。PEDVN蛋白被证实可以抑制干扰素调节因子3活性和Ⅰ型干扰素的表达，由此影响机体的免疫系统。Xu等研究发现N蛋白可以延长感染细胞的S周期，同时引起内质网应激和上调白介素8的表达。经广泛的流行调查，目前国内外流行的变异PEDV毒株S基因编码区全长4161nt，而CV777作为经典毒株的S基因长度仅为4152nt。其原因主要为变异株在S基因的S1片段有15nt插入和6nt缺失。据Chen等调查，由于进化差异，PEDV的S基因呈现了序列长度和核苷酸差异的多样性。在NCBI数据库的序列中，S基因长度从3359-4255nt，多达11种长度类型。而4161nt的长度的序列同样占绝大部分(约68.4％)，且均为2010年后被检测到的，表明目前该种类的毒株具有较明显的进化优势。除此之外，MF3809/20本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全基因组的引物组，其特征在于，所述引物组包括22个引物对，各引物对上下游引物依次如SEQ IDNO.1～SEQ IDNO.44所示。
【技术特征摘要】
1.一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全基因组的引物组，其特征在于，所述引物组包括22个引物对，各引物对上下游引物依次如SEQIDNO.1～SEQIDNO.44所示。2.一种分段扩增猪流行性腹泻病毒基因组的方法，其特征在于，所述方法为：提取待测PEDV总RNA，反转成cDNA，分别利用权利要求1所述22个引物对进行PCR扩增反应，分别进行克隆测序，最后拼接序列，得到PEDV全基因组序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，22个引物对分别为引物对5'、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、3'，各引物对上下游引物依次如SEQIDNO.1～SEQIDNO.44所示；22个引物对的退火温度分别为：引物对3'、引物对9、引物对10、引物对11、引物对13、引物对16、引物对20的退火温度均为56.1℃；引物对1、引物对6、引物对7、引物对8、引物对14、引物对17、引物对18、引物对19的退火温度均为55.2℃；引物对5'、引物对2、引物对5的退火温度均为54.1℃；引物对3的退火温度为53.0℃，引物对4的退火温度为50....
【专利技术属性】
技术研发人员：郭霄峰，莫炜钰，罗均，田钦，王怡飞，莫梅君，陈昊，赵静，胡立立，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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