基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法技术

本发明专利技术公开了基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。

【技术实现步骤摘要】
基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法
本专利技术涉及细胞融合的方法，具体是一种基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法。
技术介绍
细胞融合能够实现远源杂交，其意义在于打破了仅仅依赖有限杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方式无法获得的新型的杂交动物或植物细胞，扩大了遗传物质的重组范围。细胞融合是生物制备的基本途径。细胞能否有效融合是决定生物制备是否可行的关键，甚至成为制约生物制备技术发展的瓶颈。因此，如何发展和改进现有的细胞融合方法、提升细胞融合的效果和效率，已成为国内外生物制备领域的一个研究热点。根据电融合的基本原理，细胞膜上出现足够数量和尺寸的孔洞(即细胞电穿孔)，是细胞融合的先决条件。而细胞要发生电穿孔，细胞的跨膜电压必须大于其细胞膜穿孔所需的电压阈值。传统的微秒脉冲在细胞融合时存在一定的缺陷，电穿孔的理论研究表明，在微秒脉冲作用下，细胞跨膜电压值与细胞半径呈显著正相关。因此，微秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸有直接关系，当融合不同尺寸的细胞时，作用相同场强的脉冲，半径较大的细胞会先发生穿孔，半径小的细胞后发生穿孔，换言之，当小细胞发生穿孔的时候，大细胞可能已经处于过度穿孔的死亡状态。现有技术中，当两种细胞的半径相差1.5～5倍时，细胞难以融合或融合率极低。纳秒脉冲电场以其独特的“细胞内电处理”效应在生物医学领域得到越来越多的关注。所谓“细胞内电处理”效应，是指在外加纳秒脉冲(脉冲宽度为ns级，电场强度为MV/m级)的作用下，细胞出现一种与前述微秒脉冲电穿孔现象截然不同的生物学效应：细胞膜表面不会出现明显的电穿孔现象(即膜表面保持完整)，但细胞内部(如细胞核、线粒体等)却出现一系列功能性改变，产生大量微核，同时诱导细胞发生程序性死亡(也称之为“凋亡”)。事实上，纳秒脉冲在透过细胞外膜作用于胞内细胞器并诱导“细胞内电处理”效应的同时，也能作用在细胞外膜上并在其上产生大量纳米级尺寸的微孔。仿真和实验证明，纳秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸没有关系，纳秒脉冲能够用于不同尺寸细胞的融合。但是纳秒脉冲应用于细胞融合时存在一定的缺陷，纳秒脉冲电压作用于细胞后，虽然会在细胞膜表面产生穿孔，但是穿孔的孔径很小，并且持续的时间很短，很可能导致细胞还未融合，细胞膜上的穿孔就已经复原。因此，单纯利用纳秒或者微秒脉冲进行细胞融合都具有一定的缺陷，如果能结合利用纳秒脉冲与微秒脉冲的优势，采取复合脉冲电场的形式作用于细胞融合，对于细胞电融合领域具有十分重要的意义。
技术实现思路
目前国际上广泛使用的将微秒脉冲作用细胞融合。本专利技术的目的是解决微秒脉冲作用不同尺寸细胞融合时，存在难融合和效率低的问题。微秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸有直接关系，当小细胞发生穿孔的时候，大细胞可能已经处于过度穿孔的死亡状态，针对这种缺陷,提出一种基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法。具体是将纳秒脉冲引入细胞电融合，使细胞膜先在纳秒脉冲的作用下产生微小的“孔洞”，然后再将微秒脉冲作用细胞，使“孔洞”进一步增大，从而一定程度上提高电融合的成功率。本方法不仅可以用于相同尺寸的细胞电融合，而且可以用于融合不同尺寸的细胞。为实现本专利技术目的而采用的技术方案是这样的，基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；融合槽极板的间距无要求，不同间距的融合槽只需要改变所施加脉冲的电压即可保证得到相应的场强。2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。进一步，所述步骤1)中不同尺寸的细胞包括大细胞或小细胞，所述大细胞的半径范围为5～15μm，所述大细胞的半径是小细胞半径的2～7倍；所述大细胞的密度为2×107～5×107个/L，所述小细胞的密度是大细胞密度的五倍；所述步骤1)中的细胞为植物细胞或动物细胞；如选择的细胞为植物细胞，融合前需对植物细胞进行去壁处理再进行融合。进一步，所述步骤1)中的融合液包括体积比为(1～3)︰(1～3)︰(2～4)的PM缓冲液、酶液和CPW盐溶液；所述PM缓存液由MgCl2、CaCl2、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl2的浓度为0.05～0.4mmol/L，CaCl2的浓度为0.05～0.5mmol/L，山梨醇的浓度为200～500mmol；所述酶液由CellulaseOnzukaR-10、MecerozymeR-10和甘露醇配制而成；所述CellulaseOnzukaR-10的浓度为0.5％～3％，MecerozymeR-10的浓度为0.5％～2％，甘露醇的浓度为10％～30％；所述CPW盐溶液：KH2P04、KN03、CaCl2·2H20、MgS04·7H20、KI和CuS04·5H20配制而成；所述KH2P04的浓度为15～30mg/L，KN03的浓度为80.0～110.0mg/L，CaCl2·2H20的浓度为1200.0～1600.0mg/L，MgS04·7H20的浓度为210.0～260.0mg/L，KI的浓度为O.1～O.5mg/L，CuS04·5H20的浓度为0.025～0.1mg/L。进一步，所述步骤2)中正弦交流电压参数范围：0～100V，频率0～1MHz，持续时间：0～100s。进一步，所述步骤3)中的纳秒脉冲是通过电容充放电实现的。进一步，所述步骤3)中纳秒脉冲参数：0～5000V(场强0～15kV/cm)作用个数1～1000个，脉冲间隔0.1S～10S(频率0.1Hz～10Hz)，波形为脉冲方波，脉冲宽度50ns～500ns。进一步，所述步骤4)中的微秒脉冲参数：0～3000V(场强0～9kV/cm)，作用个数1～1000个，脉冲间隔0.1S～10S(频率0.1Hz～10Hz)，波形为脉冲方波，脉冲宽度15μs～400μs。进一步，所述步骤4)中得到的融合细胞除不同尺寸细胞融合而成外，还能够是相同尺寸细胞融合而成。值得说明的是：1)正弦交流电压作用的终止条件：观察到细胞排队；正弦交流电压到微秒脉冲电压的切换时间在5μs内。2)纳秒脉冲作用的终止条件：通过施加纳秒脉冲的个数来控制；例如：预计施加5个纳秒脉冲，当施加到5个纳秒脉冲后，就立即切换到微秒脉冲)。3)微秒脉冲作用的终止条件：通过施加微秒脉冲的个数来控制；例如：预计施加5个微秒脉冲，当施加到5个微秒脉冲后，就立马停止施加脉冲)。本专利技术的技术效果是十分显著的，本专利技术具有以下优点：1)传统的细胞电融合采取的是微秒脉冲电融合，但是微秒脉冲具有一定的缺陷，对于融合不同尺寸的细胞时，大细胞会比小细胞先产生穿孔，因此作用相同强度的电场的情况下，当小细胞发生穿孔的时候，大细胞可能早已处于过度穿孔的死亡状态。而本专利技术中的方案使用的复合脉冲作用细胞电融合，利用了纳秒脉冲不具有“细胞尺寸敏感性”的优势，能很好的融合不同尺寸的细胞。2)虽然纳秒脉冲作用下细胞膜的电穿孔效应与本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。

【技术特征摘要】
1.基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。2.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤1)中不同尺寸的细胞包括大细胞或小细胞，所述大细胞的半径范围为:5～15μm，所述大细胞的半径是小细胞半径的2～7倍；所述大细胞的密度为2×107～5×107个/L，所述小细胞的密度是大细胞密度的五倍；所述步骤1)中的细胞为植物细胞或动物细胞；如选择的细胞为植物细胞，融合前需对植物细胞进行去壁处理再进行融合。3.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤1)中的融合液包括体积比为(1～3):(1～3):(2～4)的PM缓冲液、酶液和CPW盐溶液；所述PM缓存液由MgCl2、CaCl2、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl2的浓度为0.05～0.4mmol/L，CaCl2的浓度为0.05～0.5mmol/L，山梨醇的浓度为200～500mmol；所述酶液由CellulaseOnzukaR-10、MecerozymeR-10和甘露醇配制而成；所述CellulaseOnzukaR-10的浓度为0.5％～3％，MecerozymeR-10的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成祥，柯强，姚陈果，米彦，张媛媛，董守龙，吕彦鹏，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50