一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用。该探针是利用苯并咪唑桥连咔唑衍生物构建基于分子内电荷转移效应的pH荧光探针。制法：将苯并咪唑与咔唑衍生物溶于少量N,N‑二甲基甲酰胺，加入三甲基氯硅烷催化，于封管内反应，然后加入饱和Na

【技术实现步骤摘要】
一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及溶酶体pH荧光探针，具体是一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，以及该探针在检测细胞内溶酶体pH中的应用。
技术介绍
体内pH值与细胞和细胞器的很多重要的生理过程紧密相关。不同的细胞和细胞器有不同的pH平衡值。溶酶体是一种典型的酸性细胞器，其pH值范围为4.5-5.5，异常的溶酶体pH值变化与一种被称为溶酶体贮积症的基因遗传病有关。因此有必要对溶酶体内酸性pH值的变化进行灵敏、准确的实时监测，这对于从分子水平上研究细胞的生理和病理过程具有重要的意义。迄今为止，文献报道的溶酶体pH荧光探针大多数为单光子荧光探针，通常局限于短波激发(400-560nm)，光损伤和光漂白较大；同样也会对细胞造成光损伤和自体发光，无法应用于实时高分辨检测活组织pH。溶酶体为亚细胞器，检测亚细胞器的pH值容易受到细胞内部环境影响，准确检测亚细胞器内的pH变化就需要高的空间分辨率。而近十年出现的双光子技术由于可以同时吸收两个光子，使其激发波长位于近红外区(700-900nm)，在实现深层透射的同时，避免了紫外光对生物组织的损伤及背景荧光的干扰，可满足亚细胞器(如溶酶体)高分辨检测这一要求。然而具有双光子吸收性能的溶酶体pH荧光探针的报道多为非比率型双光子溶酶体pH荧光探针。这种基于荧光强度变化的单一信号输出容易受到细胞内部环境、探针负载不均、仪器稳定性等因素干扰无法实现定量检测；相反比率型荧光探针借助两个荧光峰的比值变化，结合比率荧光成像可有效地消除这些干扰因素，实现定量检测的目标。因此，迫切需要发展有效的比率型双光子溶酶体pH荧光探针，实现对溶酶体pH波动的灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，该溶酶体pH荧光探针应呈现比率荧光发射特性，能实现准确定量检测；目的之二是提供该探针的用途，即在利用双光子成像技术在检测细胞内溶酶体pH变化中的应用。本专利技术提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针，其结构式为：本专利技术提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷按摩尔比1～1.5:1:10～15溶于N,N-二甲基甲酰胺，100～140℃加热反应20～28小时；(2)向反应液中加入饱和Na2CO3溶液调节溶液pH值至弱碱性，搅拌至少0.5小时，用CH2Cl2萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏得到粗品；(3)粗品经硅胶柱分离，得到纯品。其合成路线如下：所述步骤(1)中2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷的摩尔比为1.2:1:12，反应温度100，反应时间24小时。所述步骤(2)中搅拌时间为1小时。本专利技术的探针具有良好的细胞膜通透性，可靶向定位于溶酶体，并能应用于细胞内溶酶体pH的检测。与现有的pH荧光探针相比，本专利技术合成的探针具有以下优点：(1)利用封管作为反应容器减少了溶剂使用量，有利于环境保护；(2)大的Stokes位移，有利于减小造影过程中激发光的干扰；(4)具有合适的pKa值，适宜于检测溶酶体内pH变化；(5)良好的选择性，本探针对H+的响应不受常见金属离子和氨基酸的干扰；(6)本探针是基于分子内电荷转移(ICT)原理设计，在质子化和去质子化的过程中呈现比率荧光发射特性，实现准确定量检测；(7)在自然光和紫外灯下溶液颜色变化明显，可以通过肉眼观察；(8)该探针具有良好的双光子吸收性能，不仅可以单、双光子靶向标记溶酶体，同时能够利用双光子技术高分辨检测溶酶体内pH的变化。(9)本探针合成步骤简单，成本低廉，具有较大的实用价值。附图说明图1.本专利技术实施例1中探针在不同pH值条件下的紫外吸收光谱图。图2.本专利技术实施例1中探针在自然光下识别H+前后颜色变化。图3.本专利技术实施例1中探针在不同pH值条件下的荧光光谱图。图4.本专利技术实施例1中探针在紫外灯下识别H+前后颜色变化。图5.本专利技术实施例1中探针的荧光强度比值(F454nm/F514nm)与pH值的变化曲线图。图6.本专利技术实施例1中探针在常见金属离子和氨基酸存在下对H+的选择性。图7.本专利技术实施例1中探针的pH响应机理。图8.本专利技术实施例1中探针与市售绿色溶酶体探针(LysoTrackerGreenDND-26)在pH值7.4的条件下共同孵育30min的单光子和双光子成像图。图9.本专利技术实施例1中探针与HeLa细胞在不同pH值(pH6.0,5.5,5.0,4.5,4.0)的条件下共同孵育30min的双光子成像图。具体实施方式实施例1本专利技术探针的合成步骤如下：(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑0.446g，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛0.237g和三甲基氯硅烷按摩尔2.28ml溶于N,N-二甲基甲酰胺，100℃加热反应24小时。(2)向反应液中加入饱和Na2CO3溶液调节溶液pH值至弱碱性后，搅拌1小时，用CH2Cl2萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏得到粗品。(3)粗品经硅胶柱分离，得到纯品。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.59(m,1H)，8.47(d,J＝1.2Hz,1H),8.24(d,J＝7.6Hz,1H),7.83(d,J＝16.4Hz,1H),7.77-7.79(dd,J＝1.2Hz,1H),7.64-7.69(dd,J＝8.2Hz,2H),7.59(d,J＝7.2Hz,1H),7.45-7.49(m,2H),7.22-7.26(m,2H),7.13-7.20(m,2H),4.59(t,J＝5.4Hz,2H),3.81(t,J＝5.4Hz,2H),3.46(t,J＝4.8Hz,2H),3.31(t,J＝4.6Hz,2H),3.12(s,3H)ppm.MS(MALDI-TOF)m/z412.2022[M+H]+实施例2将实施例1中的探针用DMSO配制浓度为1mM的储备液。实验中用水/DMSO(V/V＝4/1)体系将探针稀释，使其终浓度30μM。用1mol/L的HCl调节该体系的pH值，记录不同pH条件下的紫外吸收光谱图(图1)。随着pH值由6.8降低到2.5，359nm处的吸收峰逐渐下降，396nm处的吸收峰依次增强，同时在380nm处存在一个明显的等电点。图2显示溶液颜色由无色变为黄色，左图是未加样品的无色溶液，右图为样品中加过HCl的黄色溶液。实施例3同样用水/DMSO(V/V＝4/1)体系将探针稀释到10μM进行荧光光谱滴定，固定激发波长为360nm，记录不同pH条件下的荧光发射光谱。如图3所示，在pH6.8的中性条件下，该探针的最大荧光发射位于454nm处，随着pH的降低，454nm处的荧光发射逐渐降低，在514nm处出现一个新的荧光发射并显著增强，呈现显著的比率荧光发射特性(F454nm/F514nm)。同时在500nm处出现一个清晰的等电点。在紫外灯照射下，溶液的颜色由左面样品的蓝色变为右面样品的绿色(图4)。根据荧光强度比值(F454nm/F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针，其结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针，其结构式为：2.如权利要求1所述的一种含苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷按摩尔比1～1.5:1:10～15溶于N,N-二甲基甲酰胺，100～140℃加热反应20～28小时；(2)向反应液中加入饱和Na2CO3溶液调节溶液pH值至弱碱性，搅拌至少0.5小时，用CH2Cl2萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥后，减压蒸...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛金印，樊丽，梁文婷，张凯，张雯佳，双少敏，黄文成，董川，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14