一种从杜仲叶中提取黄酮类化合物的方法技术

本发明专利技术涉及从杜仲叶中提取黄酮类化合物的方法。所涉及的方法包括：新鲜采摘的杜仲叶，于室内充分阴干；粉碎后使用浓度为50％的甲醇渗漉提取，直到流出液无色；合并提取液，减压浓缩得浸膏；浸膏用纯水按照kg/L 1:10混悬，使用等体积正丁醇进行萃取，3次；将水相和正丁醇相分别浓缩，回收溶剂；相按质量比1:3与100‑200目硅胶拌样，氯仿：甲醇体积比为5:1‑1:1作为流动相进行洗脱；收集硫酸乙醇显黄色的部分，合并；所得正丁醇相用水溶解，使用AB‑8大孔吸附树脂进行分离，得到黄酮类化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种从杜仲叶中提取黄酮类化合物的方法该申请是申请号为201410353804.x、名称为：杜仲叶中分离的黄酮类化合物作为sEH抑制剂的应用、申请日为：2014年7月23日的专利技术申请的分案申请。
本专利技术涉及药物化学，具体涉及从杜仲叶中分离得到七个黄酮类化合物及其被验证为可溶性环氧化物水解酶的抑制剂。
技术介绍
心血管疾病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。随着科技的发展，人们在治疗心血管疾病方面已经取得了很大进展。然而，每年仍有大量心血管疾病患者因无法得到有效治疗而去世。故此，人类对于心血管疾病新的治疗途径和药物具有迫切需求性。可溶性环氧化合物水解酶(solubleepoxidehydrolase，sEH)是哺乳动物体内广泛存在的一种酶。近来研究发现sEH与高血压、终末器官损伤、心肌肥厚及缺血/再灌注损伤关系密切，极有可能成为一种预防和治疗心血管疾病的新靶点(HumMolGenet，2006，15(10):1640-1649；JIntPatholClinicalMed，2008,28(5):443-446)。基于此，抑制sEH酶活性可以作为缓解和治疗高血压、终末器官损伤以、心肌肥大、糖尿病等多种心血管疾病以及抗炎镇痛的潜在治疗途径。基于尿素的可溶性环氧化物水解酶抑制剂在过去的十多年中有快速发展。相关研究结果表明这类成分具有抗高血压、抗炎以及保护心脏、肾脏和大脑免受损伤的功效。然而溶解性差，降解迅速等特点也在很大程度上限制了此类化合物的应用前景。此外，部分sEH抑制剂可以在肝脏微粒体中被快速代谢掉。后来，人们对基于尿素的sEH抑制剂从药代动力学和生物利用度两个角度进行了改进，但仍然存在诸如吸收缓慢、半衰期短和水溶性差等缺点。1951年，前苏联研究杜仲可调节血压，1976年，美国威斯康辛大学教授研究认为杜仲降血压的机理是杜仲中松脂素二葡萄糖苷的作用。此后，日本人研究发现杜仲叶中的京尼平苷和京尼平苷酸为杜仲叶降血压的有效成分；我国科学家研究认为杜仲叶的药用有效成分与皮其本相同、药用功能基本一致及杜仲叶降血压的机理是其有效成分对冠状动脉血管的扩张作用。至今未见杜仲叶中的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的有关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，目的是提供黄酮类化合物作为可溶性环氧化物水解酶抑制剂的应用。本专利技术提供的黄酮类化合物作为sEH抑制剂的应用，所述黄酮类化合物的结构式如式Ⅰ所示：式I中；上述类黄酮化合物的提取原料为杜仲叶。本专利技术的另一目的是提供了上述黄酮类化合物用于制备预防和治疗心血管疾病药物的应用。本专利技术从杜仲叶中分离得到具有可溶性环氧化物水解酶抑制活性的七个黄酮类成分。此类成分具有水溶性好，毒副作用小、含量高、分布广泛等优点。活性测试结果显示杜仲叶黄酮可以抑制sEH活性。基于可溶性环氧化物水解酶的作用原理，本专利技术提供的杜仲叶中可溶性环氧化物水解酶抑制剂，可以用于预防和治疗多种心血管疾病。附图说明图1是杜仲叶中黄酮化合物于37℃下对于可溶性环氧化物水解酶(sEH)水解底物PHOME的影响；图2EU-26米氏方程双倒数曲线；图3RU-40米氏方程双倒数曲线；图4EU-26Dixon曲线；图5RU-40Dixon曲线。具体实施方式本专利技术提供的黄酮类化合物的制备方法如下：(1)新鲜采摘的杜仲叶，于室内充分阴干；(2)粉碎后使用浓度为50％的甲醇渗漉提取，直到流出液无色；(3)合并提取液，减压浓缩得浸膏；(4)浸膏用纯水按照kg/L1:10混悬，使用等体积正丁醇进行萃取，3次。将水相和正丁醇相分别浓缩，回收溶剂；(5)水相按质量比1:3与100-200目硅胶拌样，氯仿：甲醇(5:1至1:1)作为流动相进行洗脱。收集硫酸乙醇显黄色的部分，合并；(6)继续使用AB-8大孔吸附树脂、硅胶、反相硅胶、凝胶以及HPLC等分离技术进行纯化。最终分离得到EU-6和EU-7；(7)所得正丁醇相使用少量水溶解，使用AB-8大孔吸附树脂进行分离；依次使用水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、75％甲醇和100％甲醇进行洗脱。收集30％至75％部分，分别使用硅胶、凝胶、反相硅胶以及HPLC等技术进行分离纯化；最终分离得到Eu-18、EU-23、EU-26、EU-40以及EU-43；本专利技术的黄酮类化合物的结构鉴定结果如下：EU-26，黄色固体，ESI-MSm/z:301[M-H]-,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-18，黄色固体，ESI-MSm/z:465[M-H]-,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-6，黄色固体，ESI-MSm/z:619[M+Na]+,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-7,黄色固体，ESI-MSm/z:633[M+Na]+,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-40,黄色固体，ESI-MSm/z:285[M-H]-,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-23,黄色固体，ESI-MSm/z:447[M-H]-,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2；EU-43,黄色固体，ESI-MSm/z:617[M+Na]+,13C-NMR见表1，1H-NMR见表2。表1杜仲叶黄酮13CNMR谱数据专利技术人检测了本专利技术的黄酮类化合物对可溶性环氧化物水解酶(sEH)的抑制活性：表3本专利技术的黄酮类化合物在100M时对于sEH的抑制活性编号sEH抑制活性EU-2616.7±0.2EU-1830.1±2.5EU-637.4±0.7EU-731.3±0.3EU-4019.3±1.3EU-2330.9±2.2EU-4340.4±5.9表3所示结果表明，杜仲叶黄酮成分对sEH具有一定程度的抑制活性。进一步活性测试结果如表4所示：表4AUDA为阳性对照；Ki表示抑制常数；NT表示未检测。活性测定结果表明：本专利技术的化合物对于sEH水解酶具有一定程度的抑制活性，且活性大小和结构特征存在一定的关系。其中EU-26(槲皮素)和EU-40(山奈酚)抑制可溶性环氧化物水解酶均为非竞争性抑制，其抑制常数分别为18.2M和27.5M。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从杜仲叶中提取黄酮类化合物的方法，所提取的黄酮类化合物结构式如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种从杜仲叶中提取黄酮类化合物的方法，所提取的黄酮类化合物结构式如式Ⅰ所示：其特征在于，方法包括：(1)新鲜采摘的杜仲叶，于室内充分阴干；(2)粉碎后使用浓度为50％的甲醇渗漉提取，直到流出液无色；(3)合并提取液，减压浓缩得浸膏；(4)浸膏用纯水按照kg/L1:10混悬，使用等体积正丁醇进行萃取，3次；将水相和正丁醇相分别浓缩，回收溶剂；(5)水相按质量比1:3与100-200目硅胶拌样，氯仿：甲醇体积比为5:1-1:1作为流动相进行洗脱；收集硫酸乙醇显黄色的部分，合并；(6)继续使用AB-8大孔吸附树脂、硅胶、反相硅胶、凝胶或HPLC分离技术进行纯化；分离得到R...

【专利技术属性】
技术研发人员：高锦明，白猛猛，田钧勉，张康健，雷鸣，宗时春，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61