本发明专利技术涉及兽用生物制品领域，具体公开猪支原体科特异型单克隆抗体及其在临床检测中的应用，用猪肺炎支原体做免疫原，制备了猪科支原体单克隆抗体，成功筛选到一株能稳定分泌效价高、特异性强的猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，并用其建立了猪支原体免疫检测试剂盒，本发明专利技术制备特异性强、效价高的猪支原体单克隆抗体，用其制备猪支原体病免疫诊断试剂盒，该试剂盒灵敏、准确、操作简便、采样无需采血，不给动物造成损害；该试剂盒能早期、快捷、准确地诊断猪支原体病；该试剂盒既能检测支原体病，也能检测解脲脲原体病，大大减低成本并提高检测效能。
【技术实现步骤摘要】
一种猪支原体科特异型单克隆抗体及其在临床检测中的应用
本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别是指一种猪支原体科特异型单克隆抗体及其在临床检测中的应用。
技术介绍
越来越多的研究表明，猪支原体是引起猪呼吸道及泌尿生殖道疾病的重要病原体之一，世界范围内大部分养殖猪都易感染猪支原体，而且任何年龄段的猪都会被侵害；据报道，美国养殖猪感染率为99％，英国养殖猪感染率为70％，法国养殖猪感染率为60％，比利时、加拿大养殖猪感染率为80％，德国、荷兰养殖猪感染率为50％，全世界范围平均养殖猪感染率为50％～80％。猪肺炎支原体病的典型症状是病猪咳嗽、呼吸困难、喘气，故有人称之为喘气病；猪解脲脲原体病则引起猪尿殖道感染，引起流产和不育该病发病率高，死亡率低，患病猪食欲不振、发育不良、生长缓慢，饲料转化率低。更为严重的是猪患了该病之后，很容易继发感染其他细菌和病毒病，使病程延长、病情加重，甚至死亡，经济损失加剧。对该病的诊断迄今仍主要根据流行病学分析、临床症状观察、病理解剖观察分析来进行初步诊断。迄今未见先进的检测方法，如免疫检测方法，基因检测方法商品化的试剂盒应用于该病检测诊断也未见相关的专利报道。对该病的预防迄今主要采取疫苗接种，除了接种猪肺炎支原体疫苗外，还要做好其他疾病的免疫接种工作，有计划地做好猪瘟、伪狂犬病、细小病病毒、乙型脑炎、传染性胸膜肺炎、猪丹毒、仔猪副伤寒等免疫接种工作，确保猪群良好的免疫状态。在治疗方面，目前主要采用化学药物抗生素治疗，如用泰乐菌素、四环素、土霉素、卡那霉素、金霉素及喹诺酮类等。至今未见采用无毒、无副作用的生物药物，如卵黄抗体及特异性转移因子应用于对猪肺炎支原体并进行防治的报道。迄今国内对猪支原体病的诊断仍停留在对流行病学的分析、临床症状的观察分析以及病理解剖观察来进行判断，这些较初始的诊断方法流程长、费力费时，而且很不精准。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪支原体科特异型单克隆抗体及其在临床检测中的应用，用猪肺炎支原体做免疫原，制备了猪科支原体单克隆抗体，成功筛选到一株能稳定分泌效价高、特异性强的猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，并用其建立了猪支原体免疫检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种猪支原体科特异型单克隆抗体，选用猪肺炎支原体做免疫原，筛选出猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，其生物保藏号为CGMCCNO.8011，保藏单位代码为CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年7月24日，分类命名为猪肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株，该生物材料为存活状态。制备猪支原体科特异型单克隆抗体的方法，具体包括以下步骤：S1.选取免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤细胞株选用猪肺炎支原体(168株)疫苗(生产批号：119052)作免疫原；S2.免疫动物及免疫取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml猪肺炎支原体疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别以猪肺炎支原体疫苗追加免疫一次，免疫注射疫苗量和第一次相同，第31天取脾细胞进行细胞融合；S3.细胞融合及培养(1)免疫脾细胞的制备；(2)SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备；(3)细胞融合；S4.抗体阳性孔检测；S5.克隆化；S6.杂交瘤细胞的冻存；S7.腹水型单克隆抗体的制备；S8.单克隆抗体的鉴定(采用ELISA法)共获得了3株能稳定分泌猪肺炎支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2G2，1A5和1G6，经效价检测，以上3种腹水型单克隆抗体的效价为1×10﹣4～1×10﹣5；特异性检测显示，2G2杂交瘤细胞产生的腹水型单克隆抗体除了猪支原体病外，不和蓝耳病、圆环病、猪瘟、伪狂犬病的病原体发生交叉反应；结果显示，2G2除了与肺炎支原体产生免疫反应外，还能和解脲脲原体起免疫反应。猪支原体科特异型单克隆抗体在临床检测中的应用，以所述猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2产生的单克隆抗体为基础，制备了一种猪支原体免疫检测试剂盒。一种猪支原体免疫检测试剂盒，包括样本稀释液25ml、阳性对照液0.5ml～1ml、阴性对照液0.5ml～1ml、猪肺炎支原体单克隆抗体液体2.5ml～3ml、酶标抗体液2.5ml～3ml、显色剂A2.5ml～3ml、显色剂B0.2～0.4g、洗涤液35ml×4。其中，所述试剂盒为免疫ELISA剂盒。使用所述猪支原体免疫检测试剂盒的方法，包括以下步骤：(1)样本采集：用棉拭子采集病猪口鼻及尿殖道的分泌物，放入采样管内，加入20滴样本稀释液，充分搅动棉拭子，使样本充分游离到稀释液中；(2)ELISA反应操作步骤a.将采集有样本的小管按顺序从1到22写上编号；b.取出24孔培养板，用滴管将样本采集管液按顺序分别加到培养板的小孔内，每个小孔分别加两滴样本液稀释液到1～22小孔，一次可加22个样本，第23号小孔加入阳性对照液两滴，第24号小孔加阴性对照液两滴，在常温下静置40～60分钟，甩去孔内液体；c.向培养板各小孔加入洗涤液每孔5滴，静置2～3分钟，甩去孔内液体，再重复两次，最后拍干孔内残留液体；d.向各小孔加猪肺炎支原体单克隆抗体液两滴，在常温下静置20～40分钟，甩去孔内液体；e.重复c步骤；f.向各小孔加酶标抗体液各两滴，在常温下静置30～40分钟，甩去孔内液体；g.同c步骤，但共重复5次；h.将显色剂A液倒入显色剂B管，拧紧盖子，震荡B管，待粉剂完全溶解后，加到培养板各小孔内，每孔两滴，加液后，常温下避光静置15～20分钟；(3)结果判定在白色背景下，观察小孔颜色，如果操作无误，第23号小孔为阳性对照孔应呈橙黄色，第24号小孔为阴性对照孔，应呈无色或接近无色，第1～22号小孔，如呈橙黄色，表明样本为猪肺炎支原体阳性反应，若为无色或接近无色，表明样本为阴性反应。本专利技术的有益效果在于：本专利技术制备特异性强、效价高的猪支原体单克隆抗体，用其制备猪支原体病免疫诊断试剂盒，该试剂盒灵敏、准确、操作简便、采样无需采血，不给动物造成损害。该试剂盒能早期、快捷、准确地诊断猪支原体病。该试剂盒既能检测支原体病，也能检测解脲脲原体病，大大减低成本并提高检测效能。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了克服我国对猪支原体病相对落后的诊断及防治方法，我们成功制备了猪支原体病单克隆抗体，并用其建立猪支原体病免疫检测试剂盒，其主要特点是灵敏、准确、操作简便，很快可以报结果，无需任何附加设备可在现场进行检测，采样无需抽血，不会给动物造成损害。对该病进行精准的早期诊断才能对其进行及时有效防治。另外，它能同时检测猪肺炎支原体病及猪解脲脲原体病，大大降低了猪支原体病检测成本，而且扩大了监测效能，起到事半功倍的效果。(一)猪支原体病单克隆抗体制备1.免疫原及Sp2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪支原体科特异型单克隆抗体，其特征在于：选用猪肺炎支原体做免疫原，筛选出猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，其生物保藏号为CGMCC NO.8011。
【技术特征摘要】
1.一种猪支原体科特异型单克隆抗体，其特征在于：选用猪肺炎支原体做免疫原，筛选出猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2，其产生的单克隆抗体能同时和肺炎支原体及解脲脲原体发生免疫反应，其生物保藏号为CGMCCNO.8011。2.制备权利要求1所述的一种猪支原体科特异型单克隆抗体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.选取免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤细胞株选用猪肺炎支原体(168株)疫苗(生产批号：119052)作免疫原；S2.免疫动物及免疫取雌性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml猪肺炎支原体疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别以猪肺炎支原体疫苗追加免疫一次，免疫注射疫苗量和第一次相同，第31天取脾细胞进行细胞融合；S3.细胞融合及培养(1)免疫脾细胞的制备；(2)SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备；(3)细胞融合；S4.抗体阳性孔检测；S5.克隆化；S6.杂交瘤细胞的冻存；S7.腹水型单克隆抗体的制备；S8.单克隆抗体的鉴定(采用ELISA法)共获得了3株能稳定分泌猪肺炎支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2G2，1A5和1G6，经效价检测，以上3种腹水型单克隆抗体的效价为1×10﹣4～1×105；特异性检测显示，2G2杂交瘤细胞产生的腹水型单克隆抗体除了猪支原体病外，不和蓝耳病、圆环病、猪瘟、伪狂犬病的病原体发生交叉反应；结果显示，2G2除了与肺炎支原体产生免疫反应外，还能和解脲脲原体起免疫反应。3.权利要求1所述的猪支原体科特异型单克隆抗体在临床检测中的应用，其特征在于：以所述猪支原体科单克隆抗体杂交瘤细胞株2G2产生的单克隆抗体为基础，制备了一种猪支原体免疫检测试剂盒。4.一种猪支原体免疫检测试剂盒，其特征在于：包括样本稀释液25ml、...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄威权，赵锋，吕葆真，
申请(专利权)人：深圳金石邦信股权投资基金管理有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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