一种自供能miRNA生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种自供能miRNA生物传感器的制备方法。它是基于酶生物燃料电池（EBFC）输出性能的变化实现miRNA的检测。自供能传感的设计主要集中于EBFC的阴极，将电子受体[Fe(CN)

【技术实现步骤摘要】
一种自供能miRNA生物传感器的制备方法
本专利技术涉及miRNA生物传感器的制备方法，具体地说，设计一种基于酶生物燃料电池的自供能miRNA生物传感器的制备及其超灵敏检测miRNA。
技术介绍
酶生物燃料电池（EBFC）是一种特殊的燃料电池，其能在温和条件下，利用可再生燃料提供可持续能源，受到广泛关注。基于EBFC的自供能生物传感器，是一种以电池性能输出作为分析检测信号的一类传感器，该传感器信号与被检测分析物浓度成比例关系。与传统传感器相比，自供能生物传感器检测过程中无需施加额外电源，其具体优点主要表现在：（1）设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，仅需两根电极，即EBFC的阴阳两极，便可实现检测；（2）抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；（3）能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。MicroRNA（miRNA），约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，在多种生物过程如细胞分化，凋亡，增殖和免疫反应中具有重要作用，已成为用于检测多种癌症的诊断和预后评估的新生物标志物。目前，检测miRNA表达的方法主要有Northern印迹法、miRNA阵列和实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、电化学方法。Northern印迹法方法灵敏度低、费时费力、样品需求量大。微阵列检测法同样存在灵敏度较低的缺点，并且特异性较弱。RT-PCR具有高特异性与高灵敏度，但该方法操作繁琐、RNA需分离纯化。此外，miRNAs小尺寸的特点也限制了传统RT-PCR的直接应用。并且miRNA家庭成员之间高的序列同源性也使定量分析成为挑战。因此，设计制备基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现miRNA简单、方便、高灵敏、高特异性检测非常必要。本专利技术针对这一问题，构建了基于EBFC的miRNA生物传感器，核心技术便为EBFC的构建，其中以[Fe(CN)6]3-作为EBFC的电子受体，构建生物阴极；以碳纳米管/纳米金/葡萄糖氧化酶（CNTs/AuNPs/GOx）作为生物阳极催化葡萄糖氧化。首先将电子受体[Fe(CN)6]3-封装在MSN孔中，以目标miRNA的互补链（ssDNA）封孔。当无目标miRNA时，由于互补链将[Fe(CN)6]3-封装于MSN孔中，此时阴极电子受体[Fe(CN)6]3-含量相对较少，电池输出电压低；当目标miRNA存在时，由于DNA互补配对作用，目标miRNA与互补链形成刚性双螺旋结构，远离MSN表面，孔内的[Fe(CN)6]3-释放到体系中得到电子发生还原反应。目标miRNA的引入，达到释放[Fe(CN)6]3-的目的，阴极电子受体[Fe(CN)6]3-量增加，电压输出信号增大，用于定量检测目标miRNA。本专利技术设计的基于EBFC的自供能miRNA生物传感器，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于EBFC的自供能生物传感器的制备方法，实现miRNA的简单、快速、灵敏、高效检测，有助于癌症早期诊断。本专利技术的技术方案如下：一种互补链封孔的[Fe(CN)6]3-@MSN（[Fe(CN)6]3-@MSN@ssDNA）的制备方法如图1，它由下列步骤组成：步骤1.MSN的制备：浓度为1.5~3.0mgmL-1水溶液中，加入500~1000µL2.0MNaOH溶液，在80℃下剧烈搅拌10~20min。随后，将0.5~2mL的TEOS加入到上述溶液中缓慢搅拌1~3h直到有白色沉淀产生。将得到的产物过滤，二次水和甲醇多次洗涤，并在空气中晾干。接着取一定量沉淀物在盐酸和甲醇的混合物中回流10h，以去除表面活性剂模板，制得MSN；步骤2.取一定量步骤1中制得的MSN，加入1~2倍于MSN质量的1%PDDA溶液，超声使其溶解，随后，将上述混合物在10000~15000rpm下离心10~20min并清洗多次，干燥后得到PDDA修饰的MSN；步骤3.取一定量步骤2中制得的PDDA修饰MSN与一定量浓度的[Fe(CN)6]3-混合，室温下缓慢搅拌一夜。随后，10pM~100nMssDNA加入到上述溶液中，并在室温下缓慢搅拌孵育2~6h。将最终得到的混合物在2000~5000rpm下离心1~5min，洗涤，去除未封装在孔内的[Fe(CN)6]3-，制得的[Fe(CN)6]3-@MSN@ssDNA。一种CNT/AuNPs/GOx生物阳极的制备方法，由下列实验步骤组成：步骤1.取一定量CNT分散在1~2倍于CNT质量的1%PDDA的盐溶液中，超声0.5~2h得到带正电的均匀悬浊液，离心去除剩余的PDDA（10000~15000rpm，10~20min），得到CNT/PDDA；步骤2.取一定量步骤1中制得的CNT/PDDA与1.0~5.0mL浓度为10~100nM的AuNPs相混合，在室温下缓慢搅拌一夜。离心（8000~10000rpm，10~20min）去除过量的AuNPs并将最终得到的产物重新分散；步骤3.将20~50µL步骤2中制得的CNT/AuNPs滴在ITO电极表面，在37℃下干燥2~4h，1~10mgmL-1EDC和NHS的溶液中浸泡0.5~1h，随后用二次水冲掉电极表面多余的EDC和NHS；步骤4.将步骤3中制得的电极浸泡在500~1000µL10~50mgmL-1的GOx溶液中12~24h，二次水反复洗涤，置于4℃下备用。一种基于EBFC的自供能miRNA生物传感器的搭建及测量，由下列步骤组成：步骤1.在不引入目标miRNA时，一定量[Fe(CN)6]3-@MSN@ssDNA加入到支持电解液中，测量EBFC的EOCV，记为E0OCV；步骤2.引入目标micRNA，不同浓度的目标miRNA在37℃下与一定量的MSN@ssDNA孵育1~6h，随后将上述混合物加入到支持电解液，再次测量EBFC的EOCV；上述搭建的无膜葡萄糖/氧气EBFC的支持电解液为含5mM葡萄糖pH7.4的100mMTris−HCl缓冲体系，测量装置如图2。基于EBFC的自供能生物传感器超灵敏检测miRNA的原理如图3所示：当无目标miRNA时，[Fe(CN)6]3-被互补链封在MSN的孔内，体系内仅含极少量[Fe(CN)6]3-，生物阴极几乎无电子受体接受电子，此时，EBFC的开路电压较小；当引入目标miRNA时，目标miRNA与其互补链之间由于DNA的杂交配对作用形成的刚性双螺旋结构，使得互补链脱离MSN表面，使孔内的[Fe(CN)6]3-释放到体系中，随着引入miRNA浓度的增加，脱离MSN表面互补链的量增加，释放出来的电子受体[Fe(CN)6]3-的量增加，从而导致EBFC的开路电压增加，通过开路电压增加值与目标miRNA对应关系得出miRNA含量。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点：本专利技术提供了一种基于EBFC的自供能miRNA传感器，实现miRNA简单、方便、快速、灵敏、高效检测，相对现有的miRNA检测方法，具有以下特点：（1）本专利技术所述基于EBFC的自供能生物传感器，检测过程中无需外加电源，仅需两根电极，即生物燃料电池的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自供能miRNA生物传感器制备方法，其特征是：酶生物燃料电池（EBFC）的构建。

【技术特征摘要】
1.一种自供能miRNA生物传感器制备方法，其特征是：酶生物燃料电池（EBFC）的构建。2.根据权利要求1所述的酶生物燃料电池，其特征是：酶生物燃料电池阴阳两极的组装。3.根据权利要求2所述的酶生物燃料电池阴极的组装，其特征是：[Fe(CN)6]3-电子受体储存器在生物阴极得到电子。4.根据权利要求3所述的[Fe(CN)6]3-电子受体储存器，其特征是它由下列步骤组成：步骤1.介孔硅（MSN）的制备：浓度为1.5~3.0mgmL-1水溶液中，加入500~1000µL2.0MNaOH溶液，在80℃下剧烈搅拌10~20min，随后，将0.5~2mL的TEOS加入到上述溶液中缓慢搅拌1~3h直至白色沉淀产生；洗涤、回流、去除表面活性剂模板，制得MSN；步骤2.取一定量步骤1中制得的MSN，加入1~2倍于MSN质量的1%PDDA溶液，超声溶解，随后，将上述混合物在10000~15000rpm下离心10~20min并清洗多次，干燥后得到PDDA修饰的MSN；步骤3.取一定量步骤2中制得的PDDA修饰MSN与一定量浓度的[Fe(CN)6]3-混合，室温下缓慢搅拌过夜；随后，10pM~100nM互补链（ssDNA）加入到上述溶液中，并在室温下缓慢搅拌孵育2~6h后离心（2000~5000rpm，1~5min）洗涤至少三次，去除未被封装在孔内的[Fe(CN)6]3-，得到[Fe(CN)6]3-电子受体储存器[Fe(CN)6]3-@MSN@ssDNA。5.根据权利要求2所述的酶生物燃料电池阳极的构建，其特征是它...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖盼盼，侯婷，李峰，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37