一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用。所述电化学免疫传感器以玻碳电极作为工作电极，于玻碳电极表面固定氧化石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物，然后先后在其表面电化学聚合聚苯胺纳米线和电化学沉积金纳米颗粒，抗体通过巯基‑金键固定在电极表面。将制备的免疫传感器连接至电化学工作站，可对食品中的丙烯酰胺含量进行测定。本发明专利技术的电化学免疫传感器制备方法快速高效，特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用
本专利技术涉及食品安全免疫检测
，具体地，涉及一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用。
技术介绍
丙烯酰胺是一种高水溶性的不饱和酰胺类小分子化合物，对人体具有神经毒性、遗传毒性和生殖毒性，国际肿瘤机构(IARC)把丙烯酰胺列为2A级致癌物质，即人类可能致癌物。研究表明，丙烯酰胺广泛存在于高温加工的还原糖含量高的食品中。生活饮用水是人体摄入丙烯酰胺的主要来源之一，WHO规定饮水中丙烯酰胺限量为0.5μg/L，欧盟规定饮水中限量为0.1μg/L，美国环境保护局规定的限量为0.5μg/L。因此，建立灵敏、快速、简单、高效的丙烯酰胺检测方法具有重大意义。目前丙烯酰胺的常规检测方法主要是仪器分析法，如气相色谱-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法需要昂贵复杂的仪器设备和专业的操作人员，加之样品处理繁琐、检测流程复杂、检测费用高，难以满足高通量、现场快速检测的需要，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原-抗体分子识别的免疫分析技术具有检测方法快速简单、检测限低、特异性高、检测成本低等优点，在农药、生物毒素、有机污染物、微生物等分析领域得到了广泛的研究。目前关于丙烯酰胺免疫检测技术的研究报道较少，大多采用传统的ELISA技术。Preston等将3-巯基苯甲酸(3-MBA)与丙烯酰胺的衍生产物Ade-3-MBA作为半抗原，偶联蛋白后免疫兔子得到多克隆抗体，可以特异性地检测识别Ade-3-MBA，由此建立的ELISA检测方法，对水样中丙烯酰胺的检测限为65.7μg/L。赵美萍等于2008年申请了题为“丙烯酰胺全抗原的制备及其酶联免疫定量检测方法”的专利(申请号200710090394.4)，采用N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)为半抗原，建立了丙烯酰胺酶联免疫分析方法，检测限为0.03μg/mL。2011年，Quan等建立了化学发光免疫分析方法，对丙烯酰胺的检测限为18.6ng/mL。然而，上述免疫分析方法，对丙烯酰胺的检测灵敏度还有待进一步提高。近年来，基于抗原抗体反应的免疫传感器发展迅速。抗原抗体结合前后可导致光学、热学、电化学等方面的信号改变，因此可通过对其测定得到抗原或抗体的浓度。在各类传感器中，电化学免疫传感器具有特异性强、灵敏度高的特点，被广泛应用于生物分析中。近年来，纳米材料被广泛应用于电化学免疫传感器中，纳米材料独特的性能，为光、电信号传导和新一代生物传感的设计提供了优良的载体。纳米材料具有良好的导电性和生物相容性，常作为信号放大可以提高灵敏度。目前，还未存在特异性针对丙烯酰胺的电化学免疫传感器。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器。本专利技术的另一个目的是提供一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器的构建方法。本专利技术的另一个目的是提供一种利用本专利技术设计的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器检测食品中丙烯酰胺的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，包括基底电极，所述基底电极表面修饰氧化石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物后，电化学聚合聚苯胺纳米线，然后电化学沉积金纳米颗粒，固定抗体，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。如上所述无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器的构建方法，包括以下步骤：(1)基础电极经抛光、清洗、吹干后，在基础电极表面滴加4～6μL的GO/Ag/CS溶液，烘干，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液与0.1％的CS溶液按照2～4:1的体积比混合而成；(2)将步骤(1)得到的电极清洗、吹干后，置于含苯胺的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到聚苯胺纳米线修饰的电极；(3)将步骤(2)得到的电极清洗、吹干后，置于含有氯金酸的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到金纳米颗粒修饰的电极；(4)将步骤(3)得到的电极清洗、吹干后，在其表面滴加抗体溶液，孵育过夜；(5)将步骤(4)得到的电极冲洗后，在其表面滴加BSA溶液，水浴反应后，冲洗、吹干即得。优选地，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液与0.1％的CS溶液按照3:1的体积比混合而成。优选地，步骤(2)所述苯胺的浓度为0.1～0.2mM，硫酸溶液的浓度为0.3～0.5M。优选地，步骤(3)所述氯金酸的浓度为1.5～2mM，硫酸溶液的浓度为0.3～0.5M。如上所述的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器在检测食品中丙烯酰胺的应用。优选地，所述食品为油炸食品、膨化食品或曲奇饼干。一种检测食品中丙烯酰胺的方法，包括如下步骤：(1)在如上所述的电化学免疫传感器表面滴加待测药物，恒温水浴孵育后冲洗干净；(2)将上述电极置于铁氰化钾溶液中，利用三电极系统进行微分脉冲伏安法扫描，所述铁氰化钾溶液包含3～5mM的铁氰化钾，3～5mM的亚铁氰化钾，0.1～0.2M的氯化钾。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用导电性和生物相容性好的石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物、聚苯胺纳米线、电沉积金纳米颗粒作为基底，可以很好地促进电极表面的电子传递，同时有利于固定抗体并保持其较高的活性，所构建的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器操作简单、快速，可以应用于食品中丙烯酰胺的高灵敏检测。附图说明图1为本专利技术电化学免疫传感器的原理示意图。图2氧化石墨烯/银纳米复合物的透射电镜图。图3免疫传感器修饰过程的循环伏安表征图。图4为免疫传感器对Acrylamide-4-MPA的线性响应图具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，制备方法如下：一、氧化石墨烯/银纳米复合物的制备：首先使用改进的hummers方法制备氧化石墨烯，将H2SO4/H3PO4(180:20mL)加入到3.0g325目石墨和18.0g高锰酸钾中，50℃下悬臂搅拌12h，反应物冷却到室温后倒到200mL的冰水中，加入1.5mL30％的H2O2。抽滤后4000rpm离心4h。真空干燥过夜得到氧化石墨烯。取15mg制备好的氧化石墨烯超声分散在30mL水中，透析3h除去多余的离子。磁力搅拌下加入10mL浓度为50mM的银氨溶液，继续搅拌40min，在紫外灯下照射12h。将所得黑色沉淀离心水洗3遍除去多余的银氨离子，真空干燥过夜得到氧化石墨烯/银(GO/Ag)纳米复合材料。如图2所示为氧化石墨烯/银纳米复合物的透射电镜图，可见银纳米颗粒均匀地分散在片状石墨烯上，90％的银纳米颗粒粒径在8～12nm之间，平均直径约为10nm。二、无标记型电化学免疫传感器的制备1、电极的预处理：将玻碳电极用三氧化二铝粉末在麂皮上抛光至镜面，用去离子水冲洗干净，移入超声水浴中清洗3min；然后分别用1：1的HNO3、无水乙醇和去离子水超声各清洗5min。清洗好的电极用去离子水冲洗表面，氮气吹干备用。2、免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于，所述基底电极表面修饰氧化石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物后，电化学聚合聚苯胺纳米线，然后电化学沉积金纳米颗粒，固定抗体，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。

【技术特征摘要】
1.一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，包括基底电极，其特征在于，所述基底电极表面修饰氧化石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物后，电化学聚合聚苯胺纳米线，然后电化学沉积金纳米颗粒，固定抗体，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。2.权利要求1所述无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基础电极经抛光、清洗、吹干后，在基础电极表面滴加4～6μL的GO/Ag/CS溶液，烘干，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液与0.1%的CS溶液按照2～4:1的体积比混合而成；(2)将步骤(1)得到的电极清洗、吹干后，置于含苯胺的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到聚苯胺纳米线修饰的电极；(3)将步骤(2)得到的电极清洗、吹干后，置于含有氯金酸的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到金纳米颗粒修饰的电极；(4)将步骤(3)得到的电极清洗、吹干后，在其表面滴加抗体溶液，孵育过夜；(5)将步骤(4)得到的电极冲洗后，在其表面滴加BSA溶液，水...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，孙远明，吴民富，郝欣，雷红涛，王宇，沈玉栋，杨金易，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44