具有肿瘤细胞染色的裸眼可视纳米微粒制备及微粒和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可以浸染恶性胶质瘤细胞并使其裸眼可视的纳米微粒制备方法及应用。所述纳米微粒是赖氨酸小分子在反相微乳液中经京尼平交联聚合反应得到的，叶酸靶向纳米微粒是由接枝叶酸的赖氨酸化合物在反相微乳液中京尼平交联聚合反应得到。该纳米微粒可特异性浸染恶性胶质瘤细胞，借助自身较强的细胞染色功能，使恶性胶质瘤细胞裸眼可视。

【技术实现步骤摘要】
具有肿瘤细胞染色的裸眼可视纳米微粒制备及微粒和应用
本专利技术涉及纳米医学材料领域，具体为一种具有恶性胶质瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒制备方法。
技术介绍
多形性胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)是中枢神经系统中发病率和致死率最高的恶性肿瘤。手术切除是临床上普遍采用的治疗手段，由于手术切除率直接影响其预后结果，因而术前术中精确的肿瘤定位和边缘勾勒对于多形性胶质瘤的治疗极其重要，设计并研发出能够精确定位肿瘤并引导手术切除的导航探针对尽可能彻底的切除病灶并最大程度保留脑组织具有十分重要的意义。多形性胶质瘤术前术中定位手段有组织活检、核磁共振、CT及荧光介导成像等。组织活检是临床上常用的肿瘤定性方法，误差小但耗时长达30-40min。核磁共振及CT具有放射性小、分辨率高、成像清晰等优势，但是他们提供的是“伪实时”信号，术中组织移动会造成成像偏差。近年荧光显影技术对脑瘤边界的判定越来越受重视，如荧光素钠及5-氨基乙酰丙酸盐(5-ALA)，但是488nm激发光穿透组织功能仅有1毫米，术中渗血完全遮挡来自肿瘤的荧光信号，并且由于“光漂白”的发生光敏剂会随着时间延长荧光光强降低，此外荧光剂缺乏靶向性，难以靶向修饰，同时暗室条件操作会给手术带来不便。“裸眼可视”是利用肉眼可见染料进行肿瘤染色实现无需借助仪器肿瘤裸眼就可以区分肿瘤组织与正常组织的一种方法。该方法具有简便、快捷、经济的特点，并且可以避免使用大型设备、较强的激光光源激发、荧光淬灭等问题。生物活性染料在临床上已有所应用和发展，例如美蓝、专利蓝可用于淋巴组织染色、支气管肺癌血管染色，亚甲蓝用于黑色素瘤染色等。1990年evan’sblue被用于检验脑瘤患者血脑屏障完整性，后续吲哚菁绿、荧光素钠、溴酚蓝及考马斯亮蓝用于脑瘤染色，这些染料能够对肿瘤染色效果都很好，裸眼能够清楚地区分出肿瘤组织与正常组织，但是静脉注射后小分子染料易和血清蛋白结合，被快速排出体外，并且还存在缺乏特异靶向性，使用剂量大等缺点，因而限制了其临床上的应用。纳米微粒相比小分子染料具有增强阻滞效应(EPR)、大的比表面积、表面基团可特异性修饰、降低使用剂量降低毒性等优点，2009年聂国朝等人研究纳米微粒包裹不同染料用于肿瘤染色，实验结果表明与考马斯亮蓝共价结合的聚丙烯酰胺纳米微粒体外细胞染色功能最强，体内肿瘤染色剂量可降低至35mg/mL。然而该纳米微粒的制备方法较为繁琐，需要多次合成，并且聚丙烯酰胺材料有较强的神经毒性，所以研究和开发具有较强肿瘤细胞染色功能、低毒、特异靶向及制备方法简单的纳米微粒是恶性胶质瘤细胞染色裸眼可视一大发展方向。
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的制备方法及其应用。所述纳米微粒与小分子染料相比，同等浓度下有较强的紫外可见光吸收，颜色较深，可肉眼观察。所述靶向纳米微粒具有特异性识别胶质瘤肿瘤细胞及肿瘤细胞染色功能。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供的一种具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视的纳米微粒的制备方法，以伯氨基化合物及其修饰合成产物为骨架材料，京尼平为交联剂，利用反相微乳液方法制备所得的纳米微粒。所述骨架材料为赖氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、牛血清白蛋白及其修饰物。所述反相微乳液方法中的反相微乳液体系以环己烷为油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一种或者多种为表面活性剂，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一种或者多种以上为助表面活性剂，以水溶液分散体系为水相。所述纳米微粒反相微乳体系中，伯氨基化合物浓度为1-100mg/mL，与京尼平摩尔比为8:1-1:2，反相微乳液外超声交联反应0-60min。所述纳米微粒粒径大小受伯氨基化合物浓度、伯氨基化合物与京尼平摩尔比及加入微乳液前超声交联时间影响，伯氨基化合物浓度为1-60mg/mL，与京尼平摩尔比为2:1-1:2，超声交联时间为0-1h。所述纳米微粒动态光散射检测粒径为50-200nm，透射电镜观察形貌粒径大小为5-50nm。所述纳米微粒表面带有大量负电荷，表面电势不受上述伯氨基化合物浓度、与京尼平摩尔比及交联时间影响，马尔文激光粒度仪检测为﹣25-﹣30mV。所述靶向纳米微粒的靶向分子是叶酸和RGD等，靶向分子与纳米颗粒的连接是通过酰胺键实现的。所述靶向纳米微粒，叶酸修饰化合物合成叶酸与伯氨化合物投料比为1:1。所述纳米微粒经由靶向分子叶酸修饰后，特异靶向胶质瘤U87细胞，肿瘤细胞染色的浓度为0.12-2mg/mL。本专利技术具有以下优点：反相微乳液中利用京尼平交联伯氨基化合物形成纳米微粒，借助反应生成蓝色栀子化合物的特点赋予纳米微粒深蓝色，避免直接超大剂量使用染料分子，以及纳米微粒包裹染料分子的繁琐过程。附图说明图1为本专利技术实施例提供的赖氨酸京尼平纳米微粒动态光散射粒径、电势随赖氨酸浓度、赖氨酸京尼平摩尔比以及超声交联时间的变化(a.b.c分别为纳米粒动态光散射粒径随赖氨酸浓度、赖氨酸京尼平摩尔比以及超声交联时间的变化；a’.b’.c’分别为纳米粒表面电势随赖氨酸浓度、赖氨酸京尼平摩尔比以及超声交联时间的变化)；图2为本专利技术实施例提供的赖氨酸叶酸化合物质谱图；图3为本专利技术实施例提供的靶向赖氨酸京尼平纳米微粒紫外近红外可见光光谱(FA：叶酸，Lys-g：赖氨酸京尼平纳米微粒，Lys-g-FA：赖氨酸叶酸京尼平纳米微粒)；图4为本专利技术实施例提供的赖氨酸叶酸京尼平纳米微粒透射电镜形貌观察结果；图5为本专利技术实施例提供的赖氨酸叶酸京尼平纳米微粒与其他染料相比，同等浓度下裸眼可视颜色(插图，样品浓度为50ug/mL)，紫外近红外可见光吸光度值(Lys-g-FA：赖氨酸叶酸京尼平纳米微粒，ICG：吲哚菁绿，BB：溴酚蓝，CB：考马斯亮蓝G250，样品浓度为5ug/mL)；图6为本专利技术实施例提供的靶向赖氨酸京尼平纳米微粒细胞染色效果图(纳米粒浓度为0.00-2.00mg/mL)。具体实施方式本专利技术基于伯氨基化合物赖氨酸及其改造产物叶酸赖氨酸为骨架材料，京尼平为交联剂，利用反相微乳液的方法制备生物相容性好、自身带深蓝色的纳米微粒，并进行肿瘤细胞染色。具体实施例如下：实施例11)具有肿瘤细胞染色裸眼可视的纳米微粒是以伯氨基化合物为骨架材料，京尼平为交联剂，利用反相微乳液方法制备。伯氨基化合物为小分子赖氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、牛血清白蛋白及改造修饰物。2)具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒以反相微乳液法制得，反相微乳液体系以环己烷为油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一种或者多种为表面活性剂，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一种或者多种以上为助表面活性剂，以水溶液分散体系为水相。3)具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒是在伯氨基化合物浓度为30mg/mL，与京尼平摩尔比为1:1，反相微乳液外超声交联反应2min得到的。4)具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的靶向性是靶向分子和伯氨基化合物羧基酰胺化得到的，并以10％伯氨基化合物的浓度进行交联反应。5)制备具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的的反相微乳液体系中，体积比：油相：助表面活性剂：水相＝16.5:4:1，表面活性剂在油相、助表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的制备方法，其特征在于：以伯氨基化合物为骨架材料，京尼平为交联剂，利用反相微乳液法制备得到。

【技术特征摘要】
1.一种具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的制备方法，其特征在于：以伯氨基化合物为骨架材料，京尼平为交联剂，利用反相微乳液法制备得到。2.按照权利要求1所述的制备具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的方法，其特征在于：所述伯氨基化合物为赖氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、牛血清白蛋白及它们靶向分子修饰物的一种或二种以上，靶向分子包括叶酸、RGD或靶向多肽。3.按照权利要求1或2所述具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的制备方法，其特征在于：所述的反相微乳液法中的反相微乳液体系以环己烷为油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚中的一种或者多种为表面活性剂，以乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇中的一种或者二种以上为助表面活性剂，以水溶液分散体系为水相。4.按照权利要求3所述具有肿瘤细胞染色功能的裸眼可视纳米微粒的制备方法，其特征在于：1)将环己烷、表面活性剂、助表面活性剂混合均匀，得油相；2)伯氨基化合物溶解在水中，伯氨基化合物浓度为1-100mg/mL，京尼平溶解于乙醇中，上述两种溶液混合后超声交联反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋小杰，孙广炜，张英，刘洋，吕国军，赵姗，周楠，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21