一种检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子检测方法。所述的方法以TaqMan探针实时荧光PCR为基础，使用同一条荧光探针，对混合样本中细菌组的拷贝数和人类基因组拷贝数进行测定。扩增细菌基因时选取保守区域并加入简并碱基，保证绝大数菌种都可以扩增出目的片段，而人类基因根据探针序列筛选特异性片段，根据扩增过程中产生的荧光信号与拷贝数呈正比例的趋势，得到相对应的拷贝数，最终将两者相比既得到比值。本发明专利技术满足了不同物种间基因拷贝数精确定量的需求，为深入拓展相关研究领域提供了更为广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子检测方法本专利技术涉及检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子技术检测方法，具体涉及基因荧光定量、DNA提取物成分分析等生命科学研究领域中的应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技术之一。PCR技术利用序列特异性寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶和热循环，可将DNA或cDNA模板内的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。在传统(终点)PCR中，扩增序列的检测和定量是在反应结束后分析的，如凝胶电泳和图像分析。而在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测能检测PCR产物的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)数直接成正比。通过监测指数扩增期的反应可以确定靶点的起始量，且精度极高。实时荧光定量PCR使用探针法使得特异性比常规PCR技术大大提高，目前较常提及的有TaqMan探针和FRET杂交探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团连接在探针的5′末端，而淬灭剂则在3′末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。MGB探针是探针技术基础上进一步改良而成的。MGB探针的3′端带有小沟结合物(MGB)分子。探针与靶点结合后，MGB分子结合DNA内形成的小沟，提高了探针的熔解温度值，从而增强了探针的结合能力。MGB探针的长度可以大大短于PCR引物。由于MGB基团的存在，这些探针可以较TaqMan探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。与引物相比，MGB探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。由于MGB探针具有更高的特异性，因此其被推荐应用于复杂领域。相对定量是指在实时荧光定量PCR实验中，将一个样本(已处理)中的目的基因表达与另一个样本(未处理)中相同基因的表达相比较。结果以处理样本的表达量相对于未处理样本表达量的倍数变化(增加或减少)表示。此类型的定量采用标准品内参基因(如β-actin)作为实验差异对照品。多重PCR反应饱和是指，当丰度更高的基因扩增使热稳定性DNA聚合酶饱和时，抑制了较低丰度基因的扩增，使多重分析中可能出现不可靠数据。饱和的补救措施是减少丰度更高靶点的PCR引物浓度，即“引物限制”。引物限制的浓度应足够实现几何扩增，但需在PCR产物聚集到遏制较低丰度靶点扩增之前使引物耗竭。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种检定混合DNA提取物中细菌和人类基因组拷贝数比值的方法。本专利技术建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法。当反应液中有模板时，在较高温度下荧光探针优先与模板结合，探针被分解后产生荧光信号，而信号强度与溶液中的初始模板数量成正比例，此时可以分别定量细菌基因组和人类基因组的拷贝数相对值，最后得到两者比值。本专利技术实现预期目的思路：(1)使用相同序列的MGB探针；(2)细菌引物选择各种菌的保守基因区域，并且加入简并碱基，保证绝大多数细菌都可以扩出目的片段，两对引物产生的片段在180～200bp之间；(3)实验体系分为两部分，除去引物不同，其他成分一致，这样能尽量减少两体系间的误差。本实验具体步骤如下：(1)标准品制备：大肠杆菌和幽门螺旋杆菌基因组提取物(DB)&人类全血液基因组提取物(DH)(2)探针(Probe)：FAM-5’AGTACGAGAGGAC3’-MGB-NFQ引物(Primers)：细菌组Forward5′TYAGAACGTCGTGAGACAGTT3′Reverse5′CCTGCTTAGATGCTTTCAGCR3′人类组Forward5′TCAGTGTGGCTACTGTTGTTC3′Reverse5′GGAAACAGTTTTGGCAACTG3′(3)反应体系为20μL(4)采用两步法扩增，程序如下：(5)绘制标准曲线将标准品DB和DH分别依次10倍稀释，得到六个标准品溶液，然后按照上述方法检测得到Ct值，绘制标准曲线(荧光PCR仪自动给出)，换算成相应的拷贝数，计算DB/DH值。依照上述检测步骤可以分别得到未知样品中两部分拷贝数的相对值，但若是将两对引物和探针合并，多重荧光PCR体系容易构成竞争关系，即未知浓度样品在同一个体系中，两对引物的扩增效率不尽相同，极易形成“引物限制”，如若出现此种状况必会产生巨大的系统误差。排除这种可能之外，为了弥合不同体系造成的系统误差，尽量将两体系内的必需条件做到尽可能的平行相同。与现有技术相比，所述技术方法采用非荧光淬灭剂，本底低。两部分独立的体系使用相同的探针，产生相近长度的片段，最大程度的减少系统误差，提高实验结果的精确度。该技术满足了不同物种间基因拷贝数精确定量的需求，为深入拓展相关研究领域提供了更为广阔的应用前景。附图说明图1为DB标准品的扩增曲线图2为DB标准品的标准曲线图3为DH标准品的扩增曲线图4为DH标准品的标准曲线具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1：大肠杆菌和幽门螺旋杆菌DNA提取物(DB)初始浓度溶液，10倍比稀释为106、105、104、103、102、101六个浓度为待测品，按照本方法检测得到相应的Ct值，做出扩增曲线和标准曲线如图1和图2：从两张曲线图可以看出标准曲线斜率(slope)达到-3.802，r＝-1.00基本达到线性，可以作为标准品使用，该组引物和探针扩增曲线状态良好。实施例2：人类全血液提取物DNA提取物(DH)初始浓度溶液，10倍比稀释为106、105、104、103、102、101六个浓度为待测品，按照本方法检测得到相应的Ct值，做出扩增曲线和标准曲线如图3和图4：从两张曲线图可以看出标准曲线斜率(slope)达到-3.368，r＝-1.00良好的线性水平良好，可以作为标准品使用，该组引物和探针扩增曲线状态说明设计合理，达到预期目的。实施例3：单一标准品与混合样品的一致性考察。取DB稀释100、1000、10000倍，编号为2、3、4；另取DH稀释100、1000、10000倍编号为8、9、10。六个样品单独检测和正交混合后检测得到Ct值，结果如表1：表1DB和DH的10倍比稀释正交混合液Ct值分别DBF/R和DHF/R两对引物检测相同的混合样品，相同浓度的Ct值取平均值与单独不混合的标准品(N/A)比较，可以得出混合成分样品对实验结果影响不大，只要继续优化体系成分和条件，实验误差还可以进一步缩小。实施例4：在实施例3中说明该方法重现性良好，可以使用已知比例溶液检测后验证是否符合该比例，考察方法能够达到的精确度。根据Ct值将DB和DH标准品调平到相同的浓度，拷贝数设为1.00E+05。再以这个浓度分别依次稀释十倍，为DB1.00E+03、DB1.00E+02、DB1.00E+01和DH1.00E+03、DH1.00E+02、DH1.00E+01，已知比例混合样简写为E3+3，理论比例为1000∶1000，依次类推，检测后的结果，如表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子检测方法，其特征在于，建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法，使用同一条荧光探针和两对未标记的PCR引物，对混合样本中细菌组的拷贝数和人类基因组拷贝数测定。

【技术特征摘要】
1.一种检定细菌和人类基因组拷贝数比值的分子检测方法，其特征在于，建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法，使用同一条荧光探针和两对未标记的PCR引物，对混合样本中细菌组的拷贝数和人类基因组拷贝数测定。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光探针是一段含有13个碱基的脱氧核糖核苷酸序列，5′端由FAMTM染料标记，为报告基因，而3′端结合了小沟结合物(minorgroovebinder，MGB)与非荧光性淬灭基团(NFQ)。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述两对未标记的PCR引物的产物分别为细菌23srRNA(核糖体亚基)基因和人类基因Dss1(蛋白酶体泛素受体亚基)的特异性片段。4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宁敏，徐莹洁，
申请(专利权)人：杭州致远医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33