一种木本植物花粉基因枪瞬时转化方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种高效木本植物花粉基因枪瞬时转化方法及其试剂盒。所述试剂盒中包括以下试剂组合：用于配制金粉悬液的试剂、用于制备DNA子弹的试剂以及花粉液体培养基。本发明专利技术以苹果花粉为试材，通过水合花粉、DNA子弹制备以及利用氦气轰击刚萌发的花粉粒，进行高效的基因枪瞬时转化。采用本发明专利技术的方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便地验证木本植物材料花粉管基因的功能，为直观鉴定木本植物花粉管内基因表达及功能验证提供技术体系。

Instantaneous transformation method of woody plant pollen gene gun and its reagent kit

The invention provides an efficient instantaneous transformation method for a woody plant pollen gene gun and a kit thereof. The kit includes the following reagent combinations: reagents for preparing gold powder suspensions, reagents for preparing DNA bullets, and pollen liquid cultures. The present invention uses the apple pollen as the test material, and uses the hydrated pollen, the DNA bullet to prepare and uses the helium gas to pound the newly germinated pollen grain, and carries on the instantaneous transformation of the high-efficiency gene gun. The method of the invention can realize fast, sensitive, high accuracy and simple verification of woody plant materials of pollen tube genes, provide technical system for gene expression in the visual identification of woody plant pollen tube and functional verification.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物生物
，具体地说，涉及一种木本植物花粉基因枪瞬时转化方法及其试剂盒。
技术介绍
花粉基因的遗传转化对研究其性质、功能及信号转导过程都具有重要的意义，常规的研究方法是待转基因植株到开花的阶段，取出转基因花粉进行体外培养观察。这不仅需要很长的生长周期，且由于苹果等蔷薇科高等木本果树转基因效率极低且遗传背景复杂，因此直接对花粉进行瞬时转基因，可以缩短研究生殖细胞的周期。目前对于苹果花粉瞬时转化方法已有报道，如PEG介导或者电击介导转化花粉原生质体，由于细胞壁组分复杂，造成游离效率低且再生困难，因此科研人员一直致力于寻求高效的转化方式。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于木本植物花粉基因枪瞬时转化的试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种高效木本植物花粉基因枪瞬时转化方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种用于木本植物花粉基因枪瞬时转化的试剂盒，包括以下试剂组合：用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.08～1.0μm的金粉、70％～75％乙醇和质量百分含量为50％～60％的甘油；用于制备DNA子弹的试剂：2～2.5MCaCl2、0.1～0.15M亚精胺、70％乙醇和无水乙醇；花粉液体培养基：由0.08～0.1g/ml葡萄糖、0.25～0.3mg/mlCaCl2和0.08～0.1mg/ml硼酸组成。优选地，所述试剂盒包括以下试剂组合：用于配制金粉悬液的试剂：粒径为1.0μm的金粉、70％乙醇和质量百分含量为50％的甘油；用于制备DNA子弹的试剂：2MCaCl2、0.15M亚精胺、70％乙醇和无水乙醇；花粉液体培养基：由0.1g/ml葡萄糖、0.3mg/mlCaCl2和0.1mg/ml硼酸组成。本专利技术还提供利用所述试剂盒进行木本植物花粉基因枪高效瞬时转化的方法，包括以下步骤：1)配制金粉悬液；2)制备DNA子弹；3)用培养皿体外培养花粉，收集完成水合的花粉；4)将水合完毕的花粉平铺于用花粉液体培养基湿润的NC尼龙膜上；5)装配可裂膜，打开基因枪装置，将氦气压力大小调至高于可裂膜压力，进行基因枪轰击；6)取出轰击后的花粉，用花粉液体培养基将花粉洗脱，暗培养后观察。前述方法步骤1)中，所述金粉用量为80mg，加入1.5ml70％乙醇，震荡25min；1200rpm离心15s，弃上清；加入1.5ml无菌水，继续震荡10min；1200rpm离心15s，弃上清；用1.5ml50％甘油将金粉重悬，震荡10min，得到终浓度为60mg/ml的金粉悬液，保存于4℃。前述方法步骤2)中，用分光光度计(NANODROP1000)测定携带有外源目的基因的质粒浓度约为1000ng/μl；取6μl步骤1)的金粉悬液，加入8μl上述质粒；加入8倍质粒体积的2MCaCl2后加入48μl的0.15M亚精胺；震荡仪上震荡10min；12000rpm离心20s，弃去上清；加入300μl70％乙醇，12000rpm离心20s，弃去上清；此清洗操作步骤重复2次；加入10μl无水乙醇，进行重悬。前述方法中，步骤3)采用直径为2cm的培养皿，向1g花粉中加入2ml花粉液体培养基培养花粉40min，直至花粉管长度为5μm。前述方法中，步骤4)用枪头吸取培养基底部水合完毕的花粉，平铺于用花粉液体培养基湿润的NC尼龙膜上，此操作在10cm的玻璃培养皿中进行，且培养皿中放置大小合适的浸湿的滤纸；在超净台中通风吹至NC膜上的花粉呈潮湿状态，此时大量液体培养基被吹干。前述方法中，步骤5)具体操作如下：打开基因枪装置，将氦气压力的大小调到高于可裂膜压力的100-200psi；装配1100psi的可裂膜；将涂有包被金粉的承载膜置于装置的由上至下第二格，花粉置于第三格，抽真空到26mmHg，进行基因枪轰击；抽真空以及轰击的操作步骤重复2次。前述方法中，步骤6)将轰击后的花粉用700ml花粉液体培养基进行洗脱，洗脱至直径为2cm的盛有固体培养基的平皿中，23℃黑暗培养2h后，在激光共聚焦显微镜下进行观察。本专利技术中所用固体培养基是向所述花粉液体培养基中加入浓度为0.01～0.08g/ml(优选0.01g/ml)的琼脂。本专利技术中，所述木本植物包括苹果。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种高效木本植物花粉基因枪瞬时转化方法及其试剂盒。可实现快速、灵敏、准确性高、简便地验证木本植物材料花粉管基因的功能。本专利技术以苹果花粉为试材，通过水合花粉、DNA子弹制备以及利用氦气轰击刚萌发的花粉粒，进行高效的基因枪瞬时转化，为直观鉴定木本植物花粉管内基因表达及功能验证提供技术体系。附图说明图1为本专利技术实施例1中花粉基因枪瞬时转化检测结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本专利技术试剂中各组分浓度如无特殊说明，均指终浓度。乙醇的配比为70％(70ml的无水乙醇：30ml水)；直径为1.0μm金粉；甘油的配比为50％(50ml的甘油：50ml水)。DNA溶液的浓度为1000ng/μl(1000ngDNA：1μl水)，所述CaCl2的浓度为2mol/l(0.22196gCaCl2:1ml水)，所述亚精胺的浓度为0.15mol/l(0.021792g亚精胺:1ml水)。葡萄糖浓度为0.1g/ml(10g葡萄糖：100ml水)，CaCl20.3mg/ml(30mgCaCl2：100ml水)，硼酸0.1mg/ml(10mg硼酸：100ml水)，琼脂糖0.01g/ml(1g琼脂糖：100ml水)。金粉(目录号为1652262)、1100psi可裂膜(目录号为1652329)，承载膜(目录号为1652323)购于美国Bio-rad公司，亚精胺(目录号124209)购于Sigma公司，其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。离心管等一般耗材购于Axygen公司。实施例1苹果花粉管基因枪瞬时转化方法由于本专利技术人前期克隆获得了一个苹果‘国光’花粉管中的基因，并经载体构建获得用于基因枪转化的DNA，选择‘国光’花粉为研究对象。花粉基因枪瞬时表达的流程：金粉的预处理—DNA子弹的制备—基因枪轰击—花粉收集—花粉培养—激光共聚焦显微镜观察，因此分别从以上各个步骤设计实验来确定花粉基因枪瞬时转化的方法。一、苹果花粉基因枪的制备1、苹果花粉的培养将苹果花粉分散于液体培养基表面，置于23℃培养箱中暗培40min，期间利用体式显微镜观察花粉管的长度，待花粉管长度长至5μm，可停止萌发培养。2、DNA子弹的制备向直径为1.0μm80mg金粉中加入1.5ml70％乙醇，震荡25min。1200rpm离心15s，弃上清。加入1.5ml无菌水，继续震荡10min。1200rpm离心15s，弃上清。用1.5ml50％甘油将金粉重悬，震荡10min，得到终浓度为60mg/ml金粉悬液。质粒由小量质粒提取试剂盒提取。吸取6μl处理好的金粉悬液A，加入8μl浓度为1000ng/μlDNA质粒(携带有外源目的基因)。加入64μl浓度为2.0MCaCl2后加入48μl浓度为0.15M亚精胺；震荡仪上震荡10min。12000rpm离心20本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于木本植物花粉基因枪瞬时转化的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂组合：用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.8～1.0μm的金粉、70％～75％乙醇和质量百分含量为50％～60％的甘油；用于制备DNA子弹的试剂：2～2.5M CaCl2、0.1～0.15M亚精胺、70％乙醇和无水乙醇；花粉液体培养基：由0.08～0.1g/ml葡萄糖、0.25～0.3mg/ml CaCl2和0.08～0.1mg/ml硼酸组成。

【技术特征摘要】
1.用于木本植物花粉基因枪瞬时转化的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂组合：用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.8～1.0μm的金粉、70％～75％乙醇和质量百分含量为50％～60％的甘油；用于制备DNA子弹的试剂：2～2.5MCaCl2、0.1～0.15M亚精胺、70％乙醇和无水乙醇；花粉液体培养基：由0.08～0.1g/ml葡萄糖、0.25～0.3mg/mlCaCl2和0.08～0.1mg/ml硼酸组成。2.利用权利要求1所述试剂盒进行木本植物花粉基因枪瞬时转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制金粉悬液；2)制备DNA子弹；3)用培养皿体外培养花粉，收集完成水合的花粉；4)将水合完毕的花粉平铺于用花粉液体培养基湿润的NC尼龙膜上；5)装配可裂膜，打开基因枪装置，将氦气压力大小调至高于可裂膜压力，进行基因枪轰击；6)取出轰击后的花粉，用花粉液体培养基将花粉洗脱，暗培养后观察。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述金粉用量为80mg，加入1.5ml70％乙醇，震荡25min；1200rpm离心15s，弃上清；加入1.5ml无菌水，继续震荡10min；1200rpm离心15s，弃上清；用1.5ml50％甘油将金粉重悬，震荡10min，得到终浓度为60mg/ml的金粉悬液，保存于4℃。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用分光光度计测定携带有外源目的基因的质粒浓度为1000ng/μl；取6μl步骤2)的金粉悬液，加入8μl上述质粒；加入8倍质粒体积的2MCaCl2后加入48μl的0....

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，杨清，顾钊宇，李威，李洋，于杰，刘春生，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11