一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法技术

本发明专利技术公开了一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：材料溶解、材料混合、凝胶去气泡处理、梯度因子凝胶铸模、纵向微管结构制备、冷冻干燥、梯度因子仿生神经修复支架交联、去除残留交联剂、冻干；制得梯度因子仿生神经修复支架。本发明专利技术通过制备同时具备梯度因子及纵向仿生结构的神经修复支架，通过化学因子诱导及物理拓扑诱导，协同促进神经再生，解决了目前长节段神经缺损修复材料促再生效果差，功能恢复不理想的问题。

Preparation method of gradient factor bionic nerve repairing bracket

The invention discloses a gradient factor bionic neural scaffold preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: dissolving material, material mixing, gel to bubble processing, gradient gel casting, longitudinal microtubule structure preparation, freeze drying, gradient factor bionic neural repair scaffold crosslinking, remove residual crosslinking agent freeze-dried; prepared scaffold bionic gradient factor. Through the preparation of both gradient and longitudinal bionic nerve repair scaffold, induction and physical topology induced by chemical factors synergistically promote nerve regeneration, to solve the long nerve defect repair material regeneration effect is poor, the functional recovery is not ideal problem.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学
，尤其涉及一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法及其应用。
技术介绍
周围神经损伤是临床上最严重的创伤之一。我国每年因各种原因造成的周围神经病例数额巨大。据统计，我国每年因严重创伤、先天性畸形及肿瘤切除等原因造成的周围神经损伤约200万例；根据IntegraLifeScience公司估计，全球有关神经修复的市场约为40亿美元。随着现代工业、交通及建筑业的发展，周围神经损伤的发生率呈逐年增加的趋势，给个人、家庭及社会带来沉重负担。尽管周围神经损伤后能够自发再生，并与靶组织重新建立突触联系从而恢复神经功能，但周围神经损伤的临床修复效果仍差强人意，且致残率较高。尤其是长节段(＞3cm)神经缺损，无法实施无张力缝合，修复更为困难，患者预后更差。长节段神经缺损临床治疗的金标准是自体神经移植，但供体来源有限、供区功能损害、供受神经直径不匹配等限制了自体神经的应用。目前已经商品化的神经修复支架包括Neurotube、NeuroGen、Neuromatrix等，但均存在各种问题，如神经导管壁易塌陷，缺乏内部三维结构，无法引导长距离神经缺损，更重要的是其修复效果并不理想。因此，开发一种具有更好修复效果的神经修复产品具有重要的临床意义和社会价值。在神经发育及再生过程中，梯度神经生长因子能够更加有效的诱导神经细胞生长分化。大量研究发现给予梯度神经生长因子，能够有效地诱导神经定向生长，提高神经再生的速度及功能恢复效果。此外，支架的拓扑结构，尤其是仿生学的设计对神经再生也发挥的重要的引导作用。桥接支架内部纵向排列的微管结构，能够促进神经细胞迁移以及轴突的延伸。因此将梯度因子复合入具有纵向排列的微管结构的神经支架中，有望更好的促进神经再生，取得更优的功能恢复。目前国际上尚无将梯度因子复合入具有纵向排列的微管结构的神经支架的报道，也无梯度因子仿生神经修复支架制作工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法及其应用，旨在解决目前商品化神经导管均没有诱导活性，并且缺乏内部三维结构，无法引导长距离神经缺损的问题。本专利技术是这样实现的，一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法，包括以下步骤：：步骤一，材料溶解：0～250mg取壳聚糖、0～100mgI型胶原分别溶于5ml的醋酸溶液(3～6mg/ml)，4℃，溶解24小时；步骤二，材料混合：将5ml壳聚糖溶液倒入5ml胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，搅拌速度2500～3000rpm，4min/次，间歇4min，重复混匀4次～5次；得到无神经营养因子的混合凝胶；之后取5ml混合凝胶，加入2500ngNGF或GDNF促神经再生的神经营养因子，形成500ng/ml浓度的混合有神经营养因子的凝胶；步骤三，凝胶去气泡处理：先用真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；之后离心机5000rpm离心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；最后离心机5000rpm离心3～5min；步骤四，梯度因子凝胶铸模：将混合有神经营养因子的凝胶及无神经营养因子的混合凝胶分别装入1ml注射器，并分别安装两个可编程微量注射泵，两注射器通过Y型管连接到一个混匀器。将混合有神经营养因子的凝胶和无神经营养因子的凝胶通过变速控制，注入混匀器中，之后注入圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；最终在圆柱形模具中形成一个沿纵向的因子梯度；步骤五，纵向微管结构制备：圆柱形模具装入垂直下落架，铜塞距离外部的液氮面5cm～10cm，下落架连接于匀速下降仪上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具；步骤六，冷冻干燥：去除圆柱形模具的铜塞；预冷冷冻干燥机30min～60min；冷冻干燥18h～24h，至圆柱形模具完全干燥；步骤七，梯度因子仿生神经修复支架交联：将制好支架从圆柱形模具中取出，放入20ml0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交联4小时～48小时，或放入NHS/EDC溶液交联24h～48h；步骤八，去除残留交联剂：将交联支架从交联剂中取出，放入200mlpH7.0-7.5的蒸馏水中，摇床40rpm，1小时/次，重复洗3次～6次；；步骤九，冻干：将清洗的神经支架取出，放入-80℃冷冻30分钟～60分钟，放入预冷冻干机中冻干18小时～24小时；制得梯度因子仿生神经修复支架。进一步，步骤四中，将混合有神经营养因子的凝胶及无神经营养因子的混合凝胶分别装入1ml注射器，并分别安装两个可编程微量注射泵，所述两个可编程微量注射泵通过变速注射控制，装有含神经营养因子凝胶无神经营养因子凝胶的注射器一加速，装有混合含神经营养因子凝胶的注射器二减速，两个注射器的流速之和恒定不变。进一步，梯度因子仿生神经修复支架内径为1mm～8mm；长度为1cm～10cm或者大于10cm。进一步，神经营养因子为NGF、GDNF、BDNF、NT3、VEGF、CNTF中的一种。进一步，最终在模具中形成一个沿纵向的因子梯度，因子梯度为线性浓度梯度。进一步，步骤一中，优选250mg壳聚糖、100mgI型胶原分别溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝胶；或为单纯明胶溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝胶，单纯明胶占无神经营养因子的混合凝胶的质量比为1％～5％；步骤七中，交联剂优选1％京尼平乙醇溶液，交联24小时。进一步，所述装有含神经营养因子凝胶无神经营养因子凝胶的注射器一加速，装有混合含神经营养因子凝胶的注射器二减速，两个注射器的流速之和恒定不变；具体包括：装有无神经营养因子混合凝胶的注射器一通过可编程微量注射泵一控制，凝胶流速由0μl/min逐渐加速，3min达60μl/min，之后以60μl/min恒定流速，装有无神经营养因子凝胶的注射器一再注射1min，使60μl不含因子的凝胶体积刚好为Y型管处到圆柱形模具之间通道残留的凝胶体积装有混合含神经营养因子凝胶的注射器二通过可编程微量注射泵二控制，流速由60μl/min逐渐减速，3min末达0μl/min；含神经营养因子凝胶无神经营养因子凝胶。本专利技术另一目的在于提供一种利用上述制备方法制备的梯度因子仿生神经修复支架的促进神经再生方法，该梯度因子仿生神经修复支架的促进神经再生方法包括：促神经再生的营养因子沿神经支架纵向形成由低浓度到高浓度的因子梯度，通过化学诱导方向性神经再生；同时神经支架利用纵向平行排列的微管结构，通过物理引导神经再生。本专利技术通过制备同时具备梯度因子及纵向仿生结构的神经修复支架，通过化学因子诱导及物理引导，协同促进神经再生，解决了目前长节段神经缺损修复材料促再生效果差，功能恢复不理想的问题。附图说明图1是本专利技术实施例提供的梯度因子仿生神经修复支架制备方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的梯度因子制作系统示意图；图3是本专利技术实施例提供的圆柱形模具图；图中：1、注射器一、2、注射器二；3、可编程微量注射泵一；4、可编程微量注射泵二；5、Y型管；6、螺旋混匀器；7、铜塞；8、聚四氟乙烯厚壁圆柱管。图4是本专利技术实施例提供的两可编程注射泵通过控制流速，在内径为2mm，长度为6cm的圆柱形模具内形成线性因子梯度图。图5是本专利技术实施例提供的梯度因子仿生支架扫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法，其特征在于，所述梯度因子仿生神经修复支架制备方法包括以下步骤：步骤一，材料溶解：0～250mg取壳聚糖、0～100mg I型胶原分别溶于5ml的醋酸溶液，4℃，溶解24小时；步骤二，材料混合：将5ml壳聚糖溶液倒入5ml胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，搅拌速度2500～3000rpm，4min/次，间歇4min，重复混匀4次～5次；得到无神经营养因子的混合凝胶；之后取5ml混合凝胶，加入2500ng NGF或GDNF促神经再生的神经营养因子，形成500ng/ml浓度的混合有神经营养因子的凝胶；步骤三，凝胶去气泡处理：先用真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；之后离心机5000rpm离心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；最后离心机5000rpm离心3～5min；步骤四，梯度因子凝胶铸模：将混合有神经营养因子的凝胶及无神经营养因子的混合凝胶分别装入1ml注射器，并分别安装两个可编程微量注射泵，两注射器通过Y型管连接到一个混匀器；将混合有神经营养因子的凝胶和无神经营养因子的凝胶通过变速控制，注入混匀器中，之后注入圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；最终在圆柱形模具中形成一个沿纵向的因子梯度；步骤五，纵向微管结构制备：圆柱形模具装入垂直下落架，铜塞距离外部的液氮面5cm～10cm，下落架连接于匀速下降仪上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具；步骤六，冷冻干燥：去除圆柱形模具的铜塞；预冷冷冻干燥机30min～60min；冷冻干燥18h～24h，至圆柱形模具完全干燥；步骤七，梯度因子仿生神经修复支架交联：将制好支架从圆柱形模具中取出，放入20ml 0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交联4小时～48小时，或放入NHS/EDC溶液交联24h～48h；步骤八，去除残留交联剂：将交联支架从交联剂中取出，放入200ml pH7.0‑7.5的蒸馏水中，摇床40rpm，1小时/次，重复洗3次～6次；步骤九，冻干：将清洗的神经支架取出，放入‑80℃冷冻30分钟～60分钟，放入预冷冻干机中冻干18小时～24小时；制得梯度因子仿生神经修复支架。...

【技术特征摘要】
1.一种梯度因子仿生神经修复支架制备方法，其特征在于，所述梯度因子仿生神经修复支架制备方法包括以下步骤：步骤一，材料溶解：0～250mg取壳聚糖、0～100mgI型胶原分别溶于5ml的醋酸溶液，4℃，溶解24小时；步骤二，材料混合：将5ml壳聚糖溶液倒入5ml胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，搅拌速度2500～3000rpm，4min/次，间歇4min，重复混匀4次～5次；得到无神经营养因子的混合凝胶；之后取5ml混合凝胶，加入2500ngNGF或GDNF促神经再生的神经营养因子，形成500ng/ml浓度的混合有神经营养因子的凝胶；步骤三，凝胶去气泡处理：先用真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；之后离心机5000rpm离心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；最后离心机5000rpm离心3～5min；步骤四，梯度因子凝胶铸模：将混合有神经营养因子的凝胶及无神经营养因子的混合凝胶分别装入1ml注射器，并分别安装两个可编程微量注射泵，两注射器通过Y型管连接到一个混匀器；将混合有神经营养因子的凝胶和无神经营养因子的凝胶通过变速控制，注入混匀器中，之后注入圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；最终在圆柱形模具中形成一个沿纵向的因子梯度；步骤五，纵向微管结构制备：圆柱形模具装入垂直下落架，铜塞距离外部的液氮面5cm～10cm，下落架连接于匀速下降仪上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具；步骤六，冷冻干燥：去除圆柱形模具的铜塞；预冷冷冻干燥机30min～60min；冷冻干燥18h～24h，至圆柱形模具完全干燥；步骤七，梯度因子仿生神经修复支架交联：将制好支架从圆柱形模具中取出，放入20ml0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交联4小时～48小时，或放入NHS/EDC溶液交联24h～48h；步骤八，去除残留交联剂：将交联支架从交联剂中取出，放入200mlpH7.0-7.5的蒸馏水中，摇床40rpm，1小时/次，重复洗3次～6次；步骤九，冻干：将清洗的神经支架取出，放入-80℃冷冻30分钟～60分钟，放入预冷冻干机中冻干18小时～24小时；制得梯度因子仿生神经修复支架。2.如权利要求1所述的梯度因子仿生神经修复支架制备方法，其特征在于，步骤四中...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亮亮，黄景辉，罗卓荆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61