一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法技术

本发明专利技术提供一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法，采用改进的单宁沉淀法分离提取经产纤维素酶微生物发酵产生的纤维素酶,并用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品,使纤维素酶的回收率能够达到90‑95％,具有用时短，能耗小，操作简单，纤维素酶收率高的优点。本发明专利技术克服了分离提取纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高，操作复杂等难题,适用于从海洋黑曲霉中回收纤维素酶的工业化大规模制备。本发明专利技术选用的海洋黑曲霉具有抗盐性、酶系丰富、表达量高、分泌能力强的特点。本发明专利技术方法设计合理，操作简单可行，投入设备成本低，收率高，适用于大规模分离提取纤维素酶的工业化生产。

Method for recovering cellulase from fermented ferment of marine Aspergillus niger

The present invention provides a method for recovery of cellulase from marine Aspergillus niger in fermentation liquid, using modified tannin precipitation extraction cellulase multiparous microbe fermentation and cellulase, cellulase powder products prepared by vacuum freeze drying method, the fiber recovery rate can reach 90 of the cellulase 95%, with short time, low energy consumption, simple operation, has the advantages of high yield cellulase. The invention overcomes the separation and extraction of cellulase in the whole process of lignocellulosic ethanol production in the process of high cost, complicated operation and other problems, suitable for large-scale industrialized preparation recovery of cellulase from Aspergillus niger in the preparation of the ocean. The Aspergillus niger selected in the invention has the characteristics of salt resistance, rich enzyme system, high expression quantity and strong secreting ability. The method has the advantages of reasonable design, simple and feasible operation, low cost and high yield, and is suitable for industrialized production of large-scale isolation and extraction of cellulase.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业中分离纤维素酶的方法，涉及一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法。
技术介绍
纤维素酶是地球上分布最广、最廉价、含量最丰富的多糖类物质，对人类而言，它同时又是自然界数量最大的可再生能源，它的降解是自然界碳循环的中心环节。纤维素酶能够通过水解作用将纤维素物质彻底降解，其水解产物能够进一步发酵生产乙醇、氢气及生产生物柴油的原料油脂等。因此，利用纤维素酶转化纤维素对于解决目前世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。目前，纤维素酶已被广泛用于洗涤剂工业、麻棉混纺织物后整理工业、食品工业、饲料工业、水产养殖行业，而且取得了良好的效果。生产纤维素酶的微生物多种多样，有细菌、真菌、放线菌等，目前基本上均为陆生微生物，用陆生微生物生产的纤维素酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而纤维素植物的降解一般均需要在粗犷的条件下进行，其纤维素降解效率常受到限制。海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特技能。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素酶的降解为可利用的糖类是寡养环境里的微生物采用的有限获取营养的主要方式。纤维素酶的制取方法有两种：液体发酵和固体发酵，固体发酵具有液体发酵没有的优势，菌丝能有效附着在固体发酵基质表面，提高发酵效率、比酶活高，设备单位体积生产能力高，因此固体发酵成为发酵生产工业化的一个重要方向。从发酵液中分离提取纤维素酶的工业级制备方面，柱层析分离方式由于高成本与操作的复杂性等原因很难有效的放大到工业规模。目前，工业中纤维素酶的分离方法主要有硫酸铵盐析和乙醇沉淀等。但是硫酸铵盐析后会产生大量的盐较难除去与回收，而乙醇沉淀的成本又相对较高，从而制约了木质纤维素原料及纤维素酶的大规模工业化应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对一般提取纤维素酶方法的弊端,提供一种从微生物海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法,本专利技术采用改进的单宁沉淀法分离提取经产纤维素酶微生物发酵产生的纤维素酶,并采用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品,使纤维素酶的回收率能够达到90-95％,具有用时短，能耗小，操作简单，纤维素酶收率高的优点,克服了分离提取纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高！操作复杂等难题,适用于纤维素酶工业化大规模制备。本专利技术从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法通过以下步骤实现：1、发酵液澄清：将海洋微生物固态发酵7-8天后生产的固态发酵液进行过滤、离心，得到发酵澄清液；所述的海洋微生物为海洋黑曲霉菌，Aspergillussp.ZJUBE2010,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；2、单宁沉淀：将上述发酵澄清液加入搅拌罐中,以一定的转搅拌一定时间,将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中,并持续搅拌一定时间,然后静置1-2h，进行纤维素酶的沉淀；3、沉淀收集：将经过单宁沉淀的发酵液以一定的进行离心，上清液去掉，收集沉淀；4、沉淀复溶：将上述沉淀用一定体积的浓度为20mg/ml的聚乙二醇溶液复溶，并持续搅拌一定时间，然后静置1-2h，进行复溶；5、产品收集：将上述溶液，置于离心机中以一定的转速离心一段时间，上清液即为浓缩之后的纤维素酶液，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中干燥制得粉末状纤维素酶产品。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中,对步骤1中得到的所述发酵澄清液和步骤4中经单宁沉淀聚乙二醇解析之后收集到的纤维素酶液分别用滤纸酶活力测定方法测定其纤维素酶活力。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤2中单宁的用量按照10g/L的用量向发酵澄清液中添加。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中步骤2和步骤4中，搅拌的转速为80r/min,搅拌时间为10min。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤3和步骤5中，离心的转速为4000r/min，离心时间为20min。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤4中，聚乙二醇溶液的浓度为20g/L，溶质为分子量为6000的PEG，溶剂为自然水。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤4中，聚乙二醇溶液的复溶体积根据其原发酵液体积的1/10来定。所述从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中,步骤5中真空冷冻干燥的条件是真空度为9-19Pa，温度为-50℃～-80℃，抽真空12-36h直至成粉末状无水分时为止。本专利技术的另一个目的是提供所述方法在海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶中的应用。本专利技术具有以下有益效果：通过采用改进的单宁-聚乙二醇法分离提取纤维素酶,并采用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品,使纤维素酶的回收率能够达到90-95％,具有用时短、能耗小、操作简单、纤维素酶收率高的优点,克服了分离提取纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高、操作复杂等难题。本专利技术选用的海洋黑曲霉所具有其抗盐性、酶系丰富、表达量高、分泌能力强的特点。本专利技术方法设计合理，操作简单可行，投入设备成本低，能耗小，收率高，适用于大规模分离提取纤维素酶的工业化生产。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做详细说明,以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。所述的海洋微生物为海洋黑曲霉菌，Aspergillussp.ZJUBE2010,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日。实施例1一种从海洋黑曲霉微生物发酵液中回收纤维素酶的方法，通过以下步骤实现：1、发酵液澄清：将海洋黑曲霉固态发酵7d-8d左右的发酵液进行5层纱布过滤、在离心机中以4000r/min，离心20min，得到发酵澄清液；2、单宁沉淀：将所述发酵澄清液加入搅拌罐中,将一定量的单宁加入到所述发酵澄清液中,以80r/min的转速搅拌10min，静置1h，进行纤维素酶的沉淀；3、沉淀收集：将经过单宁沉淀的发酵液，以4000r/min，离心20min，将上清液去掉，收集沉淀；4、沉淀复溶：将上述沉淀用原体积的1/10的20mg/ml的聚乙二醇溶液复溶，以80r/min持续搅拌5min时间，然后静置1h，进行复溶；5、产品收集，将上述复溶的溶液，置于离心机中以4000r/min，离心20min，上清液即为浓缩之后的纤维素酶液，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中干燥制得粉末状纤维素酶产品。所述真空冷冻干燥的条件是真空度为9-19Pa，温度为-50℃～-80℃，抽真空12-36h直至成粉末状无水分时为止。滤纸酶活(FPA)测定:取50mg(1x6cm)whatman滤纸,加入酶液0.5mL,再加入pH4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2mL,50℃反应1h,加入2.5mlDNS终止反应,沸水浴5min显色,测定A54O。酶活力定义:在上述反应条件下,每分钟催化底物水解生成1umol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中,对步骤1中得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法,，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)发酵液澄清：将海洋微生物固态发酵7‑8天后生产的固态发酵液进行过滤、离心，得到发酵澄清液；所述海洋微生物为海洋黑曲霉菌，Aspergillus sp.ZJUBE2010,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；(2)单宁沉淀：将上述发酵澄清液加入搅拌罐中,以一定的转搅拌一定时间,将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中,并持续搅拌一定时间,然后静置1‑2h，进行纤维素酶的沉淀；(3)沉淀收集：将经过单宁沉淀的发酵液以一定的进行离心，上清液去掉，收集沉淀；(4)沉淀复溶：将上述沉淀用一定体积的浓度为20mg/ml的聚乙二醇溶液复溶，并持续搅拌一定时间，然后静置1‑2h，进行复溶；(5)产品收集：将上述溶液，置于离心机中以一定的转速离心一段时间，上清液即为浓缩之后的纤维素酶液，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中干燥制得粉末状纤维素酶产品。

【技术特征摘要】
1.一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法,，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)发酵液澄清：将海洋微生物固态发酵7-8天后生产的固态发酵液进行过滤、离心，得到发酵澄清液；所述海洋微生物为海洋黑曲霉菌，Aspergillussp.ZJUBE2010,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；(2)单宁沉淀：将上述发酵澄清液加入搅拌罐中,以一定的转搅拌一定时间,将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中,并持续搅拌一定时间,然后静置1-2h，进行纤维素酶的沉淀；(3)沉淀收集：将经过单宁沉淀的发酵液以一定的进行离心，上清液去掉，收集沉淀；(4)沉淀复溶：将上述沉淀用一定体积的浓度为20mg/ml的聚乙二醇溶液复溶，并持续搅拌一定时间，然后静置1-2h，进行复溶；(5)产品收集：将上述溶液，置于离心机中以一定的转速离心一段时间，上清液即为浓缩之后的纤维素酶液，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中干燥制得粉末状纤维素酶产品。2.根据权利要求1所述的所述的一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法,其特征在于，对步骤(1)中得到的所述发酵澄清液和步骤(4)中经单宁沉淀聚乙二醇解析之后收集到的纤维素酶液分别用滤纸酶活力测定方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑刚，曲丽丽，泮红文，杨志坚，陈磊，陈逸文，戴林伟，
申请(专利权)人：浙江大学舟山海洋研究中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33