一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒，所述构建方法依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。本发明专利技术环状RNA高通量测序文库的构建方法高效、稳定，rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。

Construction method of loop RNA high throughput sequencing library and its reagent kit

The invention discloses a construction of a cyclic RNA high-throughput sequencing library method and kit, the construction method comprises the following steps: (S1) the total RNA was extracted from the sample; (S2) DNA; (S3) detection and assessment of total RNA in the sample quality, determine the RNA quality to meet requirements; (S4) rRNA (S5) removal; removal of linear RNA; (S6) for the construction of circular RNA Library of high-throughput sequencing. The invention of cyclic RNA high-throughput sequencing library construction method is efficient and stable, low proportion of residual rRNA, cyclic RNA detection data with high efficiency, good repeatability, sequencing results show a high success rate, especially suitable for FFPE organizations such as the poor quality of the sample RNA.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒。
技术介绍
环状RNA(ciucularRNA,circRNA)是一种区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，其为不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴且以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。早在1980年，环状RNA就已经被发现，但是在很长的一段时间内，由于研究技术水平的限制，环状RNA被认为是错误可变剪切而形成的副产品，属于自然界中一种极罕见的现象，且甚至被当做遗传意外或实验人为因素所致，并未引起学术界重视。随着深度RNA测序和规模化生物信息技术的发展，研究者才发现在生物体内存在大量环状RNA分子。2012年Salzman等人通过高通量测序的方法发现了环状RNA广泛存在人的转录组当中，从而引起人们对环状RNA研究的兴趣。2013年Hansen等人发现CDR1as/CiRS-7可以作为miR-7sponge调控基因表达，证实了环状RNA在人体内的重要作用。最新研究表明环状RNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征。目前已有研究显示环状RNA跟神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良、癌症等疾病相关，并且在人唾液和血液中检测到环状RNA的存在，则表明环状RNA可以在血液，尿液，腹水等临床标本中稳定存在，这些特征使得环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。CN104388548A公开了一种高通量环状RNA测序的方法，其包括：人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；对外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；将外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；向待测序样本的总RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；对第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除标记上生物素的套索RNA及线性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的线性RNA，得到第四混合物；对第四混合物进行标准的高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。该方法步骤复杂，且需要预先合成外源RNA。由于环状RNA无法直接分离，故而迄今文献中对于环状RNA文库构建并没有一个标准的方法，大多数研究中采用去除rRNA并去除线性RNA，然后再构建用于高通量测序文库的方法，也有一小部分研究是去除rRNA后直接建库，或者去除线性RNA后直接建库，还有极小一部分研究是采用去除PolyA+RNA后建库的方法。这些方法存在rRNA去除不彻底，数据重复性差等缺点。因此，如何高效、稳定地构建用于环状RNA高通量测序的文库，仍然是亟待解决的一个技术难题。此外，目前市场上还没有专门的环状RNA建库试剂盒，需要科研人员从QIAGEN、Illumina、Backman、NEB、Lifetechnology等多家公司分别购买RNA提取、rRNA去除、线性RNA去除、文库构建等产品，然后摸索合适的条件进行建库。这种多家试剂组合建库一方面价格昂贵，另一方面需要有较高实验技能的科研人员花费较长的时间去摸索最佳实验条件，严重限制了环状RNA研究的进展，因此有必要开发一款能高效、稳定地构建用于环状RNA高通量测序文库的专用试剂盒。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术专利技术人对环状RNA测序进行反复研究和分析，开发出一种能够高效稳定地构建环状RNA高通量测序文库的方法，该方法rRNA残留比例低，数据重复性较好，且该方法尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。为了实现上述目的，本专利技术提供一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S1)中提取样品中的总RNA是采用Trizol法进行的，该方法特别适用于组织和细胞样品。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S2)中去除样品中的DNA是采用DNaseI消化法进行的。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S3)中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；(S33)检测RNA的完整性。更优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S33)中检测RNA的完整性是利用Agilent2100生物分析仪进行的。在本专利技术中，OD(opticaldensity)表示被检测物质吸收掉的光密度，OD260/280比值是指在波长260nm和280nm处的吸光光度比值，用于判断RNA的纯度。理论上，在纯RNA的情况下OD260/280比值为2，其中OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S4)中去除rRNA是采用RNaseH消化法进行的。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S4)去除rRNA依次包括以下步骤：(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；(S43)用RNaseH消化所获得的DNA-RNA杂交物；(S44)用DNaseI消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1，优选1:1。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S43)中用RNaseH消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S45)中测定rRNA耗竭的RNA的浓度所采用的荧光计是通过Qubit荧光计进行的。优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S5)中去除线性RNA是采用RNaseR消化法进行的，其中RNaseR与RNA的用量比为(2.5-3.5)U:1ug，优选3:1，即每1微克RNA中加入3个活性单位(U)的RNaseR。更优选地，在所述环状RNA高通量测序文库的构建方法中，所述步骤(S5)中去除线性RNA所采用的RNaseR消化法的消化条件为在35-45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S3)中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；(S33)检测RNA的完整性。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S4)去除rRNA依次包括以下步骤：(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；(S43)用RNaseH消化所获得的DNA-RNA杂交物；(S44)用DNaseI消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1，优选1:1。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃。6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S43)中用RNaseH消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖炳权，罗景燕，何重华，何铭辉，李伟琴，唐毅，黄鸿昌，
申请(专利权)人：广州永诺生物科技有限公司，广州永诺健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44