一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法。该方法利用聚乙酰亚胺敏化的TiO2八面体锐钛矿介观晶体作为光活性基底材料，通过硼掺杂碳量子点标记肽(B‑CODs@petide)对基底材料的信号放大作用，制备一种光电化学传感器并应用于胰蛋白酶的检测。基于PEI的稳定性及优良导电性，其与OAM复合能加快光生电子的转移速度并提高光电流信号，而具有竞争性捕光能力的B‑CODs及空间阻碍的肽链的引入将明显的降低光电流信号，当修饰电极在胰蛋白酶溶液中孵化，胰蛋白酶可以催化水解肽键，使B‑CODs@petide从电极表面释放，从而提高光电流信号，光电流信号与胰蛋白酶浓度在1×10

One based on TiO

The invention discloses a method based on TiO

【技术实现步骤摘要】
一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法
本专利技术属于新型功能材料与生物传感检测
，具体涉及一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法。
技术介绍
近年来，在医疗诊断和病原体识别中利用高效的生物传感器的构建实现简单的蛋白质检测得到越来越广泛的关注。预测及诊断癌症以能够早期干预和更好的管理疾病，作为诊断工具，肿瘤标志物发挥了重要的作用。胰蛋白酶是一种由胰腺产生重要的消化酶，其控制胰腺外分泌功能。此外，大量的疾病与胰蛋白酶的浓度水平变化密切相关，例如，囊性纤维化，胰腺炎，坏疽，和胎粪性肠梗阻。因此，发展一种简便有效的胰蛋白酶生物测定及对其抑制剂的监测的方法有着重要的治疗意义。目前，检测胰蛋白酶的生物测定方法主要有酶联免疫吸附试验、电化学和荧光光谱等。然而，这些方法的灵敏度的进一步增强及探索一个低背景信号，重现性好，宽的响应范围的传感平台仍然是胰蛋白酶测定的迫切要求。光电化学（PEC）检测，是基于光电化学过程和化学/生物识别过程建立起来的一种新的分析方法。该方法以光作为激发信号，以光电流作为检测信号，具有灵敏度高、响应快速、设备简单和易微型化等优点，为临床诊断、环境监测与食品安全等领域提供了一种强有力手段。光电化学分析使用光作为激发信号，检测的是电信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。光电材料的类型、性能与光电化学过程的实现有着直接且紧密的关系，光电材料本身的光电化学性质、制备方法、复合效果、形貌控制、电荷传导速率等对于光电化学过程的顺利实现有重要影响。TiO2纳米材料因其独特的光催化活性、无毒性，优异的化学和物理稳定性，使其成为光催化和光电化学传感器的理想材料。二氧化钛的性能一般受晶型、晶粒大小、晶面、结晶度、比表面积、微结构等的影响。TiO2介观晶体是晶体亚单元有序排列构成的，相比于传统的TiO2单晶，TiO2介观晶体具有更加优良的太阳能转换和催化性能，能显著提高PEC性能。然而，TiO2禁带宽度较大，只能被紫外光激发，因此在可见光区光电转换效率较低。高电荷的共轭聚电解质（CP）由于大的吸收截面和良好的光稳定性可以轻易地组装在传感平台来满足高通量检测方法。本专利技术通过一个简单的和无添加剂的热溶剂法合成八面锐钛矿型介观晶体（OAM）并引入一个典型的共轭聚电解质聚乙烯亚胺（PEI）来进一步提高OAM的光电转换效率。而具有竞争性捕光能力的硼掺杂碳量子点及空间阻碍的肽链的引入将明显的降低光电流信号，当修饰电极在胰蛋白酶溶液中孵化，胰蛋白酶可以催化水解含精氨酸羧基端的肽键，使硼掺杂碳量子点标记肽(B-CODs@petide)从电极表面释放，从而提高光电流信号，光电流信号与胰蛋白酶浓度在一定范围内呈线性，实现胰蛋白酶的高灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于TiO2介观晶体的光电化学传感器的制备。本专利技术的目的之二是将该光电化学传感器应用于胰蛋白酶的高灵敏检测。本专利技术目的是这样实现的，本专利技术所述的一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极的制备：滴加4μL浓度为3mg/mlOAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入0.5mg/mlPEI溶液中40min，室温条件下晾干；继续滴加5μL浓度为5.0wt.%的戊二醛溶液于电极表面，4°C冰箱中放置1小时，接着用pH7.4的磷酸缓冲溶液洗去多余的戊二醛，修饰电极在B-CODs@petide溶液中4°C冰箱中孵化1h，通过经典的戊二醛交联法将硼掺杂碳量子点标记肽修饰到电极表面；将修饰电极浸入20μL浓度为1.0wt.%的BSA1h，封闭电极表面上非特异性活性位点；用pH7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极；3）胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH7.4的PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-7mg/mL–1.0mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。所述的OAM材料的由下述方法制备的：钛酸盐纳米线沉淀用稀醋酸溶液洗涤并调节pH值至3.5，60ºC条件下干燥12h获得前驱体钛酸纳米线，取400mg前驱体钛酸纳米线分散在70ml醋酸溶液中，于100聚四氟乙烯高压反应釜中200ºC条件下反应48h，所得到的产物用蒸馏水和无水乙醇离心洗涤，60ºC条件下干燥12h并400ºC下煅烧30分钟，以除去残余的有机物，制得TiO2八面体锐钛矿介观晶体（OAM）。所述的B-CODs@petide溶液由下述方法制备的：1）硼掺杂碳量子点(B-CODs)的制备：将2.1克对苯二酚，10ml丙酮和5.16mlBBr3溶液混合并转移到25mL聚四氟乙烯高压反应釜中200°C条件下加热2h，反应完成后，将高压釜冷却至室温，并通过旋转蒸发浓缩溶液，获得B-CODs；2）硼掺杂碳量子点标记肽(B-CODs@petide)溶液的制备：10μL浓度为10mg/ml硼掺杂碳量子点分散在50μl浓度为1.0wt.%的（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷(APTES)溶液，搅拌20min并超声2小时后，8000转速下离心15分钟，获得的沉淀重新分散在DMF中获得APTES功能化的B-CODs；同时，10μL含有20mg/ml的EDC和NHS10mg/ml的水溶液加入30μL浓度10mg/ml的肽溶液中4°C条件下放置4小时，活化生物肽的羧基（-COOH）；随后，将40μL混合溶液加入60μL所制备的APTES功能B-CODs溶液，4°C条件下轻轻摇动10h；在这一过程中，通过硼掺杂碳量子点表面的胺基（-NH2）与生物肽的羧基(-COOH)之间经典的EDC和NHS偶联反应得到B-CODs@petide；最后，所制备的B-CODs@petide重新分散到pH7.4的100μL的磷酸缓冲溶液中。本专利技术所述的一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的，1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极的制备：滴加4μL、3mg/mlOAM悬浮液于干净的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于TiO

【技术特征摘要】
1.一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极的制备：滴加4μL浓度为3mg/mlOAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入0.5mg/mlPEI溶液中40min，室温条件下晾干；继续滴加5μL浓度为5.0wt.%的戊二醛溶液于电极表面，4°C冰箱中放置1小时，接着用pH7.4的磷酸缓冲溶液洗去多余的戊二醛，修饰电极在B-CODs@petide溶液中4°C冰箱中孵化1h，通过经典的戊二醛交联法将硼掺杂碳量子点标记肽修饰到电极表面；将修饰电极浸入20μL浓度为1.0wt.%的BSA1h，封闭电极表面上非特异性活性位点；用pH7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极；3）胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以PEI/OAM/B-CODs@petide修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH7.4的PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-7mg/mL–1.0mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的OAM材料的由下述方法制备的：钛酸盐纳米线沉淀用稀醋酸溶液洗涤并调节pH值至3.5，60ºC条件下干燥12h获得前驱体钛酸纳米线，取400mg前驱体钛酸纳米线分散在70ml醋酸溶液中，于100聚四氟乙烯高压反应釜中200ºC条件下反应48h，所得到的产物用蒸馏水和无水乙醇离心洗涤，60ºC条件下干燥12h并400ºC下煅烧30分钟，以除去残余的有机物，制得TiO2八面体锐钛矿介观晶体（OAM）。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的B-CODs@petide溶液由下述方法制备的：1）硼掺杂碳量子点(B-CODs)的制备：将2.1克对苯二酚，10ml丙酮和5.16mlBBr3溶液混合并转移到25mL聚四氟乙烯高压反应釜中200°C条件下加热2h，反应完成后，将高压釜冷却至室温，并通过旋转蒸发浓缩溶液，获得B-CODs；2）硼掺杂碳量子点标记肽(B-CODs@petide)溶液的制备：10μL浓度为10mg/ml硼掺杂碳量子点分散在50μl浓度为1.0wt....

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宏，林燕语，高利红，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35