三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体及其构建方法和应用。该三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNA

Preparation and application of triple artificial miRNA inhibiting VEGFRs

The invention discloses a triple artificial miRNA for inhibiting VEGFRs carrier, a construction method and an application thereof. The triple artificial miRNA inhibited the VEGFRs vector at pcDNA

【技术实现步骤摘要】
三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用。
技术介绍
胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、早期诊断率低、进展迅速、预后极差。其病死率居恶性肿瘤死亡率中男性第4位、女性第3位。近年来虽然多种方法在胰腺癌的诊治方面取得了一定的进展，但其预后极差，术后复发转移率高，对放疗、化疗不敏感，容易产生多药耐性，5年存活率仍然低于4％。提高胰腺癌的治疗效果，是医疗界面临的一个治疗难题，因此探索基因靶向治疗及其作用机制具有重要意义。最理想的治疗靶点是只针对肿瘤细胞及其周围的肿瘤微环境，靶向药物杀死恶变细胞的同时又不影响正常细胞的生长。目前国内外研究报道显示，肿瘤的靶向治疗以肿瘤新生血管为靶点具特异、高效、安全的特点，且无针对血管的耐药性，其中以血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血管内皮生长因子受体(Vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)家族的三个亚型(VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3，以下统称VEGFRs)为靶向治疗肿瘤的重要目标。血管生成是包括胰腺癌在内的实体肿瘤生长和转移的必要因素，肿瘤细胞分泌的VEGFRs和肿瘤的发生发展密不可分，同时成为治疗肿瘤的理想靶点。随着肿瘤微环境作用的研究深入，揭示肿瘤间质成分不但和肿瘤生长和转移有关，而且与上皮间质转化(epithelialmeserlchymaltransition，EMT)现象以及靶向治疗作用区密切相关。近年来研究报道EMT参与胰腺癌的转移，不但在上皮细胞来源的恶性肿瘤侵袭转移中起重要作用，并与肿瘤抗凋亡现象有密切关系，出现EMT的胰腺癌患者预后明显差。因为某些上皮源性的肿瘤在经历EMT过程中，细胞形态、表面标志物以及运动侵袭能力发生改变，使细胞对化疗药物的敏感性亦产生显著的改变。因此，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性改变以及耐药现象的产生在EMT现象发生的机制中发挥了重要的作用。由此可见，VEGFRs在胰腺癌中高表达可能与EMT现象也有内在联系，抑制VEGFRs在癌中的表达，也许会降低EMT现象发生的后果，其最后结果则是患者病情进展减慢，生存期延长。近年来系统生物学的出现和不断发展为药物发现提供了一种全新的思路—多靶点药物治疗，同时，对疾病网络系统的进一步研究和认识也揭示了调节单一靶点在复杂疾病治疗中的局限性，多角度攻击疾病系统可以同时调节疾病网络系统中的多个环节，不易产生耐药性，现已应用于多种重大疾病，尤其适用于肿瘤，由于肿瘤的发生发展是由多基因参与的多步骤、多阶段、体内外因素相互作用的复杂过程，多靶点药物治疗会产生协同效应，从而使总效应大于各单效应之和。随着多靶点药物技术的不断成熟，已有越来越多的多靶点治疗药物不断产生。近年来证据表明，MicroRNAs(miRNAs)突变或者异位表达与多种人类癌症相关，人工miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，可在癌症治疗中起重要作用。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的提供一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体。本专利技术的另一目的是提供上述三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法。本专利技术还有一目的是提供上述三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的在制备治疗癌症药物中的应用，以期实现为治疗癌症药物的制备提供有效途径。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNATM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗癌症药物中的应用。所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，步骤如下：1)通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体；2)通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo中间载体；3)通过引物miRNA-3F、3R扩增miRNA-3表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo和miRNA-3表达框PCR回收产物分别采用KpnI和NheI酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-Tri-miRNA/GFP-Neo载体。所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，miRNA-1F：CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-1R：CCGATGCATGCTACGACTCACTATAGGGGATGCT；miRNA-2F：CCGTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGACATTGATTATTGAC；miRNA-2R：CCGCAGGAAACAGCTATGACCTACGACTCACTATAGGGG；miRNA-3F:CCGGTTGACATTGATTATTGACTAGTT；miRNA-3R:CCGTACGACTCACTATAGGGGATGCT。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术的三联amiRNA，降低胰腺癌细胞增殖，促使凋亡增加，并降低了细胞迁移和侵袭能力；在裸鼠移植胰腺癌模型，三联amiRNA-VEGFRs显著降低了肿瘤的生长，与化疗药物协同作用，并与抑制上皮-间质转化有关；并且对胰腺形态、外周血的胰岛素和血糖水平无影响。可见针对抑制VEGFRs的三联人工miRNA在制备用于治疗胰腺癌等高表达VEGFRs的恶性肿瘤中具有很好的应用。附图说明图1是VEGFRs蛋白在人胰腺癌组织上的表达结果图；图2是VEGFRs在5株细胞系中表达水平图；图3是三联人工miRNA-VEGFRs载体构建示意图；图4是胰腺癌细胞系中用筛选最佳的人工miRNA沉默VEGFRs图；图5是三联人工miRNA-VEGFRs抑制胰腺癌细胞VEGFRs蛋白表达图；图6是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的增殖能力图；图7是三联人工miRNA-VEGFRs影响胰腺癌细胞的侵袭能力图；图8是流式细胞术测三联本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，其特征在于，在pcDNA

【技术特征摘要】
1.一种三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，其特征在于，在pcDNATM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用。2.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗癌症药物中的应用。3.权利要求1所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：1)通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体；2)通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄剑飞，王志伟，咸云，曹学敏，李洁莹，张筱静，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32