一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备制造技术

本发明专利技术涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法：首先以N,N‑双(丙烯酰基)胱胺和含疏水基团的氨基酸通过迈克尔加成方法进行共加聚反应，再经过酯化和酰肼化反应，合成得到三元共聚物，最后在选择性溶剂中通过自组装形成聚两性离子纳米胶束。由于共聚物链段中含有双硫键和两性离子，因而纳米胶束具有还原敏感性，以及优异的抗蛋白质非特异性吸附性能；该纳米胶束可共价负载阿霉素药物。本发明专利技术的纳米胶束生物相容性好，可在体内完全降解，有望用作抗癌药物载体。

Preparation of a reduced susceptibility micelle with covalent drug loading

The present invention relates to the technical field of biomedical materials, particularly relates to a method for preparing drug loaded covalent redox sensitive nano micelles: first N, N double (acryloyl) and cystamine containing hydrophobic amino acids by the Michael addition method of CO addition polymerization, after esterification and hydraziding the reaction, synthesized three copolymer in selective solvent, finally formed through the self-assembly of zwitterionic polymer micelles. Due to the presence of disulfide bonds and zwitterionic copolymer chains, and nano micelles with reduction of sensitivity, and excellent anti protein adsorption properties of the nano micelles; covalent adriamycin drug load. The nano micelle of the invention has good biocompatibility and can be completely degraded in vivo, and can be used as an anti-cancer drug carrier.

【技术实现步骤摘要】
一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备
本专利技术涉及生物医用材料
，尤其涉及一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，根据世界卫生组织的报道，癌症是全球一个主要死亡原因。目前治疗癌症的方法主要包括外科手术切除、化学药物治疗(化疗)和辐射治疗。这些治疗手段都存在很大缺陷，例如药物产生毒副作用，损伤正常组织器官，对于患者而言都是极大的痛苦。为了克服药物直接输送所带来的严重弊端，20世纪80年代兴起的纳米技术与聚合物材料的结合，产生了一系列新型的纳米给药系统：聚合物胶束、囊泡、脂质体以及微球，将药物物理包覆进载体或与载体化学结合，可有效降低药物对正常组织的毒副作用；通过赋予载体特殊的生理刺激响应性，可改善药物在体内的分布，直达组织病变区，并在病变区差异性的温度、pH以及氧化还原剂的作用下释放出药物，从而提高了药物的生物利用度。以纳米粒子为基础的生物技术已经成为药物输送以及其他医学领域的发展前沿，但作为药物输送系统，目前一个很大的障碍是纳米粒子在体内的非特异性蛋白吸附，这会导致载体与血液蛋白相互作用导致聚集以及免疫反应，这些问题严重的限制了载药纳米粒子在临床上的应用。为了保证纳米粒子的循环稳定性，PEG经常被用来修饰载体外层。PEG优越的亲水性能，可以减少蛋白吸附，避免载体被网状内皮系统清除。然而有相关报道指出，PEG在氧气和过渡金属离子存在下会发生自然氧化，即PEG末端的羟基在体内乙醇脱氢酶的作用下被氧化成醛基，从而使其失去抗蛋白吸附性能。此外，PEG自身的“隐身”屏蔽作用同样会使癌细胞对其识别困难，使癌细胞对载体的摄取率大大降低。基于对细胞膜结构的仿生学研究，发现细胞膜表面磷酰胆碱的两性离子结构具有优异的抗蛋白吸附功效。常见的两性离子结构有羧基甜菜碱类(CBMA)、磺酸基甜菜碱类(SBMA)、磷酰胆碱类(MPC)以及氨基酸类，这些结构通过离子键作用形成致密的水合层，在抗蛋白吸附的同时，可稳定药物载体，因此两性离子聚合物可替代PEG用来修饰纳米粒子的表面。谷胱甘肽(GSH)是一种含有巯基的三肽，是生物化学反应中一类重要的还原剂，能够还原双硫键。还原型谷胱甘肽在细胞质中较为丰富，浓度为1-10mM，但在血液中含量较少，一般浓度为2μΜ；较正常组织而言，GSH在肿瘤细胞中的浓度大约高达4～10倍。利用这一特点，可以设计含双硫键的药物载体，使其对于肿瘤细胞内的GSH产生响应，有目标的在细胞内释放抗癌药物。聚两性离子纳米胶束负载药物时通常有两种方式：一是通过聚合物连段与药物分子的疏水相互作用；二是通过药物载体中的带电荷离子与药物中的异性离子相互作用。但是这两种方式容易带来药物泄露和难以条件控制释放问题。
技术实现思路
根据上述原因，本专利技术的目的是提供一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法。首先由N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和其他疏水性氨基酸三种单体通过迈克尔加成合成三元共聚物，然后将共聚物中疏水性氨基酸的羧基经过甲酯化，再与水合肼反应得到聚(赖氨酸-co-N,N-双(丙烯酰基)胱胺-co-α-氨基苯丙酰肼)三元共聚物，最后在水溶液中通过自组装形成可共价载药的还原敏感性纳米胶束。本专利技术中迈克尔加成反应所选溶剂除了水之外，还需加入可溶解疏水组分的极性有机溶剂，如二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇或乙醇等；反应温度控制在50℃左右，该温度有助于仲胺与双键反应，从而顺利形分子量较大的共聚物。三种单体单元在纳米胶束中具有各自的功能作用：1)N,N-双(丙烯酰基)胱胺分子中含有双硫键，使载体具有还原响应性，可在谷胱甘肽作用下断链，使载体遭到破坏；2)赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，分子中同时含有羧基和氨基，形成聚两性离子，赋予药物载体抗蛋白质非特异性吸附性能以及pH敏感性；3)氨基酸是人体内源性物质，其疏水性基团为聚合物的自组装和载药性能奠定基础；而氨基酸中的羧基经过甲酯化后可与水合肼反应生成酰肼，便于与阿霉素以腙键共价结合，在酸性条件下腙键断裂可控制药物释放。本专利技术中合成的第一步是迈克尔加成共聚，采用的原料是N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和疏水性氨基酸，为了得到高聚物，在加料时控制N,N-双(丙烯酰基)胱胺的摩尔数与氨基酸的摩尔数之和相等。具体在所述合成步骤1)中，迈克尔加成反应所选溶剂为极性有机溶剂与去离子水的混合液，体积比为2:1，极性有机溶剂包括二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醇或甲醇；所选催化剂为0.1Wt％氢氧化钠水溶液，调节pH在10.5～12.0范围内，利于增加氨基的亲核性；当迈克尔加成反应完成后，在所述合成步骤2)中，将氨基酸中的羧基甲酯化，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热到60℃，反应4.5小时，然后酯键与水合肼反应生成酰肼结构；水合肼的浓度为10Wt％,其摩尔数是氨基酸摩尔数之和的2～3倍，在65℃温度下回流反应8小时。本专利技术还提供一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束在制备药物载体中的应用方法，在DMF溶剂中，加入纳米胶束干粉与盐酸阿霉素，在三乙胺共存下，室温反应24小时；然后用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析，最后冷冻干燥。利用N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸与疏水性氨基酸通过迈克尔加成得到的聚合物同时含有双硫键、氨基以及羧基等多功能响应性基团。在人体内，肿瘤组织与正常组织相比，温度、pH以及氧化还原环境等都有较大的差异，利用这些差异而设计的具有刺激响应性的纳米载体，可以实现药物在靶向部位的释放。在体内循环过程中，载体中的双硫键在细胞外低谷胱甘肽浓度(2μmol·L-1)下能够保持稳定，而一旦进入细胞内，高浓度谷胱甘肽(2～10mM)会使双硫键迅速破坏，促使药物从中释放出来；同时，肿瘤组织的pH(<6.5)比正常组织pH(≈7.4)低，而且肿瘤细胞内溶酶体和内涵体的pH在4.5～6，载体中的胺基在酸性条件下质子化会使载体发生溶胀，从而进一步破坏载体结构，将药物充分释放。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：1.利用迈克尔加成合成聚合物，操作简便，反应条件温和，反应较为彻底，无其他副产物生成。2.由于该聚合物链段中同时含有双硫键、氨基和羧基等结构单元，因而赋予了纳米胶束灵敏的pH和还原响应性，在肿瘤细胞内部弱酸性和还原性环境中，胶束结构被破坏，从而可顺利释放药物。3.双硫键位于聚合物主链，在癌细胞内部高浓度谷胱甘肽作用下，双硫键的断裂会使整个聚合物降解，无大分子残留，在实际应用中可避免材料残留而引发的副作用。4.聚合物中的氨基和羧基，不仅可以替代PEG作为稳定胶束的亲水部分，而且胶束表面的电荷赋予胶束优异的抗蛋白吸附功效，可延长载体体内循环时间。5.含酰肼结构的纳米胶束容易与阿霉素共价结合，增加了载药稳定性和控制释放的可能性。6.利用氨基酸以及生物碱为原料合成的聚合物，具有良好的生物相容性。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1本专利技术中的纳米胶束负载阿霉素药物的结构示意图；图2N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸与苯丙氨酸以摩尔比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：1)将赖氨酸、N,N‑双(丙烯酰基)胱胺和含疏水基团的氨基酸三种单体在碱催化下，在水与极性有机溶剂的混合溶剂中通过迈克尔加成反应得到三元共聚物；2)将此三元共聚物经过酯化、再与水合肼反应得到含酰肼基团的共聚物溶液；3)共聚物溶液经过透析纯化、冷冻干燥后得到固体粉末，将粉末溶解在二甲亚砜中，持续搅拌下向三元共聚物溶液中缓慢滴加超纯水；4)滴水结束后，搅拌一段时间将溶液转入透析袋中，透析处理得到纳米胶束。

【技术特征摘要】
1.一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，依次包括以下步骤：1)将赖氨酸、N,N-双(丙烯酰基)胱胺和含疏水基团的氨基酸三种单体在碱催化下，在水与极性有机溶剂的混合溶剂中通过迈克尔加成反应得到三元共聚物；2)将此三元共聚物经过酯化、再与水合肼反应得到含酰肼基团的共聚物溶液；3)共聚物溶液经过透析纯化、冷冻干燥后得到固体粉末，将粉末溶解在二甲亚砜中，持续搅拌下向三元共聚物溶液中缓慢滴加超纯水；4)滴水结束后，搅拌一段时间将溶液转入透析袋中，透析处理得到纳米胶束。2.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，含疏水基团的氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和对羟基苯丙氨酸。3.根据权利要求1所述的一种可共价载药的还原敏感性纳米胶束的制备方法，在所述步骤1)中，N,N-双(丙烯酰基)胱胺、赖氨酸和含疏水基团的氨基酸三种单体的摩尔比为1:0.9:0.1、1:0.8:0.2、1:0.7:0.3、1:0.6:0.4、1:0.5:0.5、1:0.4:0.6、1:0.3:0.7、1:0.2:0.8或1:0.1:0.9。4.根据权利要求1所述的一种可...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽萍，丁媛媛，倪才华，石刚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32