大黄鱼干扰素h基因启动子序列及其应用制造技术

大黄鱼干扰素h基因启动子序列及其应用，涉及干扰素IFNh基因启动子。提供大黄鱼IFNh基因启动子序列、大黄鱼IFNh基因启动子的活性分析方法、大黄鱼IFNh基因启动子的应用。采用基因组步移的方法克隆了大黄鱼IFNh基因启动子，提供了大黄鱼IFNh基因启动子序列；经报告基因分析实验证明了该大黄鱼IFNh基因启动子可被poly(I:C)、LPS、PGN及细菌基因组DNA诱导激活。该大黄鱼IFNh基因启动子的克隆及其强启动子活性的鉴定，在理论上将为研究大黄鱼IFNh基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件。

Promoter sequence of interferon H gene of large yellow croaker and its application

Large yellow croaker interferon H gene promoter sequence and its application, relating to interferon IFNh gene promoter. The IFNh gene promoter sequence of large yellow croaker, the method for analyzing the promoter activity of IFNh gene of large yellow croaker and the application of IFNh promoter of Pseudosciaena crocea were provided. Methods using genome walking and cloned the IFNh gene promoter of large yellow croaker, Pseudosciaena crocea provides IFNh gene promoter sequence; the reporter gene analysis results proved that the large yellow croaker IFNh gene promoter by poly (I:C), LPS, PGN and DNA induced activation of bacterial genome. The large yellow croaker IFNh gene cloning and identification of the strong promoter activity, provides a good experimental system to study the mechanism of expression regulation of IFNh gene in large yellow croaker in theory, in the application for the use of the promoter construct the expression vector of exogenous gene expression or the promoter used in the construction of transgenic fish to create conditions.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干扰素IFNh基因启动子，尤其是涉及大黄鱼干扰素IFNh基因启动子序列及其应用。
技术介绍
干扰素(Interferon，IFN)是一类能诱导脊椎动物细胞抗病毒状态，并在抗病毒防御中起重要作用的诱导性多基因家族细胞因子(1.RobertsenB.Theinterferonsystemofteleostfish[J].FishShellfishImmunol,2006,20(2):172-191)。硬骨鱼类作为低等脊椎动物也拥有相对完善的干扰素系统。鱼类IFNs分为I型IFNs和II型IFNs两大类，其中I型IFNs因其专一性地协调宿主抗病毒免疫而受到更多的关注(2.ZhangYB,GuiJF.Molecularregulationofinterferonantiviralresponseinfish[J].DevCompImmunol,2012,38(2):193-202.)。根据成熟肽中半胱氨酸的数量及分布，鱼类I型IFNs分为groupIIFN(成熟肽含2个半胱氨酸)和groupIIIFN(成熟肽含4个半胱氨酸)。GroupIIFN包括IFNa、IFNd和IFNe3个亚组，groupIIIFN包括IFNb、IFNc和IFNf3个亚组(3.ZouJ,GorgoglioneB,TaylorNG,etal.SalmonidshaveanextraordinarycomplextypeIIFNsystem:characterizationoftheIFNlocusinrainbowtroutoncorhynchusmykissrevealstwonovelIFNsubgroups[J].JImmunol,2014,193(5):2273-2286)。基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。鉴于鱼类I型IFNs在抗病毒免疫及病毒病防治中的重要性，研究其基因表达调控机制将为通过调节IFN的表达来防治鱼类病毒病提供新的思路。对鱼类I型IFNs基因5′侧翼调控区序列的分析表明，鱼类I型IFNs基因启动子存在多个转录因子结合位点，如IRF3、IRF7、NF-κB和ISRE等，并且具有复杂的表达调控机制。本申请人在前期通过全基因组序列分析，发现了1条编码大黄鱼I型IFN的基因序列(4.AoJQ,MuYN,XiangLX,etal.GenomesequencingoftheperciformfishLarimichthyscroceaprovidesinsightsintostressadaptation[J].PlosGenet,2015,11(4):e1005118)。同源比对及进化分析表明该I型IFN为1种新的鱼类I型IFN，暂命名为IFNh，属于鱼类groupIIFNs。由于启动子是决定基因表达及其调控的关键因素，为研究大黄鱼IFNh基因的表达调控机制，从其基因组进一步克隆了大黄鱼IFNh基因的5′侧翼启动子序列，经报告基因检测实验证明了该大黄鱼IFNh基因启动子具有较强的启动子活性。该大黄鱼IFNh基因启动子的克隆及其启动子活性的验证，在理论上将为研究大黄鱼IFNh基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该强启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件，具有重要的理论和实际意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供大黄鱼IFNh基因启动子的序列。本专利技术的目的之二在于提供一种大黄鱼IFNh基因启动子的活性分析方法。本专利技术的目的之三在于提供大黄鱼IFNh基因启动子的应用。本专利技术所述大黄鱼IFNh基因启动子的序列为：本专利技术所述一种大黄鱼IFNh基因启动子的活性分析方法如下：1)采用Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统定量分析了该启动子的活性，以及人工合成双链RNApoly(I:C)、大肠杆菌脂多糖LPS、枯草芽孢杆菌肽聚糖PGN和嗜水气单胞菌基因组DNA刺激对其活性的影响；2)将大黄鱼IFNh基因启动子区片段插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pGL3-IFNhP；用重组载体pGL3-IFNhP和海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞，48h后收集转染细胞；利用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性；3)以空载体pGL3-Basic和海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞的荧光素酶相对活性作为对照，计算出该启动子的相对活性；再用poly(I:C)、脂多糖LPS、肽聚糖PGN及细菌基因组DNA刺激pGL3-IFNhP转染的EPC细胞，通过分析各处理组荧光素酶相对活性的变化，确定大黄鱼IFNh基因启动子的活性是否受刺激物诱导的影响。所述大黄鱼IFNh基因启动子的应用如下：1)所述大黄鱼IFNh基因启动子的克隆及其启动子活性的鉴定，可在构建大黄鱼IFNh基因的表达调控机理实验系统中应用；2)所述大黄鱼IFNh基因启动子可在构建真核表达载体在鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中应用；3)所述大黄鱼IFNh基因启动子可在构建转基因鱼中应用。本专利技术的突出优点和技术效果如下：本专利技术采用基因组步移的方法克隆了大黄鱼IFNh基因启动子，提供了大黄鱼IFNh基因启动子序列；经报告基因分析实验证明了该大黄鱼IFNh基因启动子可被poly(I:C)、LPS、PGN及细菌基因组DNA诱导激活。因此，该大黄鱼IFNh基因启动子的克隆及其强启动子活性的鉴定，在理论上将为研究大黄鱼IFNh基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造了条件，具有重要的理论和实际意义。附图说明图1为采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析大黄鱼IFNh基因启动子的活性。横坐标pGL3表示空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(作为对照)；pGL3-IFNhP为重组载体pGL3-IFNhP转染EPC细胞的荧光素酶相对活性。如图1所示，重组载体pGL3-IFNhP转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的3.6倍，说明了大黄鱼IFNh基因启动子可以较好地启动荧光素酶报告基因的转录。每个实验设三次重复，每次重复设三个平行。误差靶代表平均值的标准差。图2为在不同剂量poly(I:C)刺激条件下大黄鱼IFNh基因启动子的活性变化。横坐标分别表示在0ng、50ng、100ng、200ngpoly(I:C)刺激条件下重组载体pGL3-IFNhP转染EPC细胞的荧光素酶相对活性。纵坐标表示在转染相同剂量poly(I:C)条件下，重组载体pGL3-IFNhP转染EPC细胞中荧光素酶相对活性相对于空载体pGL3-Basic转染EPC细胞的荧光素酶相对活性(定义为1)的增加倍数。如图2所示，在poly(I:C)剂量为0ng、50ng、100ng及200ng时，重组载体pGL3-IFNhP转染EPC细胞中的荧光素酶相对活性为空载本文档来自技高网...

【技术保护点】
大黄鱼IFNh基因启动子，其特征在于其序列为：

【技术特征摘要】
1.大黄鱼IFNh基因启动子，其特征在于其序列为：2.如权利要求1所述大黄鱼IFNh基因启动子的活性分析方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统定量分析了该启动子的活性，以及人工合成双链RNApoly(I:C)、大肠杆菌脂多糖LPS、枯草芽孢杆菌肽聚糖PGN和嗜水气单胞菌基因组DNA刺激对其活性的影响；2)将大黄鱼IFNh基因启动子区片段插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pGL3-IFNhP；用重组载体pGL3-IFNhP和海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK共同转染EPC细胞，48h后收集转染细胞；利用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，丁扬，敖敬群，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35