一种结构光照明超分辨显微成像方法技术

本发明专利技术公开了一种结构光照明超分辨显微成像系统及其成像方法。本发明专利技术的成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；本发明专利技术通过成像图像重建算法处理原始图像，只需要旋转4次结构光条纹，不需要相位平移即可实现超分辨；成像图像重建算法基于频域处理而非空间域处理；样品的超分辨图像的频谱的过程，与传统频域方法不同，并非逐个结构光方向进行解析，而是将所有方向合并进行解析；为获得传统的各向均一的2倍分辨率提升，理论上原始图像数量可以从传统方法的9幅减少至4幅；进一步减少原始图像数量至3幅，理论上可获得各向均一的1.5倍左右的分辨率提升。

Structured light illumination super-resolution micro imaging system and imaging method thereof

The invention discloses a structured light illumination super-resolution microscopic imaging system and an imaging method thereof. The imaging system of the present invention includes: light source, rotating structure light generator, the first lens, beam splitter, lens, stage, samples, second converging lens, digital imaging equipment and a computer; the invention through image processing the original image reconstruction algorithm, only need to rotate 4 stripe, without phase shift can be implementation of super resolution imaging; image reconstruction algorithm based on frequency domain instead of spatial domain processing; super-resolution image spectrum of the samples, different from the traditional frequency domain method, not by structure light direction analysis, but all the direction of merger analysis; increased to 2 times the resolution of traditional anisotropic uniform theory, the original the number of images from the traditional method of 9 pieces can be reduced to 4; to further reduce the number of the original image to obtain 3 images, each theory. Upgrade to a resolution of about 1.5 times the average.

【技术实现步骤摘要】
一种结构光照明超分辨显微成像系统及其成像方法
本专利技术涉及光学显微成像技术，具体涉及一种结构光照明超分辨显微成像系统及其成像方法。
技术介绍
超分辨光学显微技术利用对荧光发射在空间或时间上的调制，实现了突破光学衍射极限的显微成像。结构光照明超分辨显微成像技术(StructureIlluminationMicroscopy,SIM)，是在宽场荧光显微的基础上，利用特殊调制的结构光照明样品，运用特定算法从调制图像中提取高频信息，突破衍射极限的限制。二维SIM的常规重建方法需要至少9张原始图像。该重建方法由Gustafsson提出[1]，在每一个照明方向取3个不同的初相位值，获得3幅原始图像，通过解线性方程组得到频域中的高频成分；为保证在各个方向上分辨率均得到2倍提升，通常照明条纹需选取3个不同方向，也就是说总共需要9张原始图像。另外Heintzmann和Cremer提出了一种四相位重构方法，计算量小，但在每一方向的照明条纹需要获取4幅原始图像，且对照明条纹的初相位取值精度的要求较高，因而并不常用[2]。有一些新方法可以将重建所需的图像数量降低，最低可至到4张[3,4]，但这些方法基于空间域的迭代，而非传统方法中的频域求解，既有可能产生更多的伪像，也未能提供迭代一定收敛的理论解释。并且这些降低所需图像数量的方法，对结构光位相的精度要求更高。而从系统搭建的角度看，利用光栅来产生照明条纹时，需用机械的方式来控制光栅平移，造成速度和精度的牺牲。
技术实现思路
针对以上现有技术中存在的问题，本专利技术提出了一种结构光照明超分辨显微成像方法及配套成像系统；本专利技术的成像方法能有效降低需要的原始图像数量，且能只需旋转照明条纹，不需平移。本专利技术的一个目的在于提出一种结构光照明超分辨显微成像系统。本专利技术的结构光照明超分辨显微成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；其中，数字成像设备通过数据线连接至计算机；照明光源发出激发光；激发光经旋转结构光生成器发生衍射；衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光；荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，再经第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机；计算机形成原始图像；旋转样品上的结构光条纹至新的角度，在每一个角度上分别采集形成一幅原始图像，形成4幅以上或3幅的原始图像；通过成像图像重建算法处理原始图像，得到样品的超分辨图像。旋转结构光生成器采用光栅、数字微镜阵列或空间光调制器。如果旋转结构光生成器采用光栅，则将光栅或者放置样品的载物台设置在旋转装置上，旋转装置以光轴为旋转轴，带动光栅或载物台能够360°旋转，从而带动光栅与样品之间发生相对角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度；如果旋转结构光生成器采用数字微镜阵列或空间光调制器，通过数字方式生成光条纹产生角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度。照明光源采用激光光源、LED光源或汞灯光源。分光镜采用二向色镜或半透半反镜。本专利技术的另一个目的在于提供一种结构光照明超分辨显微成像方法。为获得传统的各向均一的2倍分辨率提升，理论上原始图像数量可以从传统方法的9幅减少至4幅；进一步减少原始图像数量至3幅，理论上可获得各向均一的1.5倍左右的分辨率提升。本专利技术的结构光照明超分辨显微成像方法，原始图像不少于4幅，包括以下步骤：1)激发光经旋转结构光生成器发生衍射，衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光，荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，由第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机，计算机形成原始图像；2)旋转样品上的结构光条纹至新的角度，重复步骤1)，在每个角度采集形成一幅原始图像，直至在M个不同的角度下形成M幅原始图像，M≥4；3)将每一幅原始图像进行离散傅里叶变换，获得各幅原始图像的频谱Dn，其中Dn为第n张原始图像的频谱，n＝1,2,……,M，M≥4；4)计算每幅原始图像对应的结构光条纹的方向和相位，根据结构光条纹的方向和相位计算得到结构光条纹的频谱In，其中In为第n个结构光条纹的频谱；5)样品的超分辨图像的频谱S，结构光照明超分辨显微成像系统的光学传递函数(OTF)H，结构光条纹的频谱In和原始图像的频谱Dn满足下式：其中为卷积，·为点乘；从上式得到，各幅原始图像的频谱Dn在各个像素上的值，均是超分辨图像的频谱S的多个像素的值的线性组合，其系数由In和H决定；故将上述公式改写为下述线性方程组：d＝Ms其中，向量d是所有原始图像的频谱的各个像素的值，一维向量s是样品的超分辨图像的频谱的各个像素的值，M是构造得到的稀疏卷积矩阵；6)解上述线性方程组得到向量s，将一维向量s重排得到二维的样品的超分辨图像的频谱，然后通过傅里叶逆变换得到样品的超分辨图像。其中，在步骤2)中，旋转结构光生成器采用光栅、数字微镜阵列或空间光调制器；如果旋转结构光生成器采用光栅，则将光栅或者放置样品的载物台设置在旋转装置上，旋转装置以光轴为旋转轴，带动光栅或载物台能够360°旋转，从而带动光栅与样品之间发生相对角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度；如果旋转结构光生成器采用数字微镜阵列或空间光调制器，通过数字方式生成光条纹产生角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度。本专利技术的结构光照明超分辨显微成像方法，原始图像为3幅，包括以下步骤：1)激发光经旋转结构光生成器发生衍射，衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光，荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，由第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机，计算机形成原始图像；2)旋转样品上的结构光条纹至新的角度，重复步骤1)，在每个角度采集形成一幅原始图像，直至在3个不同的角度下形成3幅原始图像；3)将每一幅原始图像进行离散傅里叶变换，获得各幅原始图像的频谱Dn，其中Dn为第n张原始图像的频谱，n＝1,2,3；4)计算每幅原始图像对应的结构光条纹的方向和相位，根据结构光条纹的方向和相位计算得到结构光条纹的频谱In，其中In为第n个结构光条纹的频谱；5)样品的超分辨图像的频谱S，结构光照明超分辨显微成像系统的光学传递函数(OTF)H，结构光条纹的频谱In和原始图像的频谱Dn满足下式：其中为卷积，·为点乘；从上式得到，各幅原始图像的频谱Dn在各个像素上的值，均是超分辨图像的频谱S的多个像素的值的线性组合，其系数由In和H决定；故将上述公式改写为下述线性方程组：d＝Ms其中，向量d是所有原始图像的频谱的各个像素的值，一维向量s是样品的超分辨图像的频谱的各个像素的值，M是构造得到的稀疏卷积矩阵；6)解上述线性方程组得到向量s，将一维向量s重排得到二维的样品的超分辨图像的频谱，然后通过傅里叶逆变换得到样品的超分辨图像。其中，在步骤2)中，旋转结构光生成器采用光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结构光照明超分辨显微成像系统，其特征在于，所述超分辨显微成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；其中，所述数字成像设备通过数据线连接至计算机；所述照明光源发出激发光；激发光经旋转结构光生成器发生衍射；衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光；荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，再经第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机；计算机形成原始图像；旋转样品上的结构光条纹至新的角度，在每一个角度上分别采集形成一幅原始图像，形成4幅以上或3幅的原始图像；通过成像图像重建算法处理原始图像，得到样品的超分辨图像。

【技术特征摘要】
1.一种结构光照明超分辨显微成像系统，其特征在于，所述超分辨显微成像系统包括：照明光源、旋转结构光生成器、第一会聚透镜、分光镜、物镜、载物台、样品、第二会聚透镜、数字成像设备和计算机；其中，所述数字成像设备通过数据线连接至计算机；所述照明光源发出激发光；激发光经旋转结构光生成器发生衍射；衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光；荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，再经第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机；计算机形成原始图像；旋转样品上的结构光条纹至新的角度，在每一个角度上分别采集形成一幅原始图像，形成4幅以上或3幅的原始图像；通过成像图像重建算法处理原始图像，得到样品的超分辨图像。2.如权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述旋转结构光生成器采用光栅、数字微镜阵列或空间光调制器。3.如权利要求2所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，如果旋转结构光生成器采用光栅，则将光栅或者放置样品的载物台设置在旋转装置上，旋转装置以光轴为旋转轴，带动光栅或载物台能够360°旋转，从而带动光栅与样品之间发生相对角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度；如果旋转结构光生成器采用数字微镜阵列或空间光调制器，通过数字方式生成光条纹产生角度变化，使得样品上的结构光条纹旋转至新的角度。4.如权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述照明光源采用激光光源、LED光源或汞灯光源。5.如权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述分光镜采用二向色镜或半透半反镜。6.一种结构光照明超分辨显微成像方法，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：1)激发光经旋转结构光生成器发生衍射，衍射的激发光经第一会聚透镜会聚后，经二向色镜，由物镜聚焦，照射在放置在载物台上的样品上，形成结构光条纹；样品在结构光条纹的激发下发射荧光，荧光经物镜聚焦后，经二向色镜后，由第二会聚透镜会聚，由数字成像设备采集荧光，并将光信号转换成电信号后传输至计算机，计算机形成原始图像；2)旋转样品上的结构光条纹至新的角度，重复步骤1)，在每个角度采集形成一幅原始图像，直至在M个不同的角度下形成M幅原始图像，M≥4；3)将每一幅原始图像进行离散傅里叶变换，获得各幅原始图像的频谱Dn，其中Dn为第n张原始图像的频谱，n＝1,2,……,M，M≥4；4)计算每幅原始图像对应的结构光条纹的方向和相位，根据结构光条纹的方向和相位计算得到结构光条纹的频谱In，其中In为第n个结构光条纹的频谱；5)样品的超分辨图像的频谱S，结构光照明超分辨显微成像系统的光学传递函数H，结构光条纹的频谱In和原始图像的频谱Dn满足下式：其中为卷积，·为点乘；从上式得到，各幅原始图像的频谱Dn在各个像素上的值，均是超分辨图像的频谱S的多个像素的值的线性组合，其系数由In和H决定；故将上述公式改写为下...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿密特·莱尔，席鹏，赵堃，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11