基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，包括信号产生探针和捕获探针，所述信号产生探针和捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID ON.1～15所示，该传感器用于均相溶液中乳铁蛋白的高灵敏性检测。本发明专利技术在不改变适配体高亲和力和特异性的前提下优化了适配体的结构。在该方法中，两段截断适配体分别修饰异硫氰酸荧光素(FITC)和银纳米粒子(Ag

Fluorescence polarization aptamer sensor based on double signal amplification and its application

The invention discloses a fluorescence polarization dual signal amplification of aptamer based sensors, including signal generation probe and capture probe, the signal generation probe and capture probe nucleotide sequence of SEQ ID ON.1 ~ 15, the sensor for high sensitivity detection of lactoferrin in homogeneous solutions. The invention optimizes the structure of the aptamer without changing the affinity, the high affinity and the specificity of the aptamer. In this method, two segments of truncated aptamers were modified with fluorescein isothiocyanate (FITC) and silver nanoparticles (Ag, respectively)

【技术实现步骤摘要】
基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器及其应用。
技术介绍
适配体是功能化的单链DNA或RNA，一般为10～100碱基。适配体可以特异性结合一系列的目标物，如小分子、病毒、蛋白、多肽和病毒等。利用指数富集配基系统进化技术(SELEX)可以从大量随机文库中获得与靶标分子高亲和力结合的适配体。与传统的抗体或者分子印迹聚合物相比，适配体在实际应用中具有易合成、修饰方便、稳定性好以及价格低廉等优点。在靶标分子存在情况下，适配体折叠成发卡环、臂环结构、G4连体等结构特异性识别目标。目前为止，上百种目标物的适配体已经被报道。为了减小适配体产生的位阻效应，人们设计出截断适配体来提高检测效果。在过去的十几年里，截断适配体与一些新型的材料连用发展成为新型的适配体荧光传感器和电化学传感器。总体上，荧光传感器可以分为signal-on传感器、signal-off传感器、比色法传感器、电化学发光传感器等。总体来说，这些适配体传感器均基于夹心法原理，两条截断适配体同时用于产生信号和捕捉适配体。然而该类夹心法在识别位点数目上有别于传统的夹心法。因为报道过的截断适配体均自组装成整个适配体来结合蛋白，因此报道过的截断适配体只有一个结合位点。对于大分子量蛋白来说，荧光偏振法不失为一种十分有效的检测手段。荧光偏振法主要基于加入目标分子后引起的复合物转动速率变化原理，复合物分子转动越慢荧光偏振信号越强。在均相溶液中，荧光偏振法以准确性、简便性、快速、自动化以及高通量检测著称。直接荧光偏振检测法会产生一定的背景和有限的信号强度，因此其检测效果远不如其他方法好。信号扩增方法包括结构转变、重量扩增以及目标引起的替换方法被广泛采用。但是现有的方法并不能完全满足现代检测的要求，我们需要发展更多的荧光偏振信号放大方法来提高信号、降低背景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器，以解决现有技术中荧光偏振检测法会产生背景信号、干扰检测的问题。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器在检测乳铁蛋白含量中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，包括信号产生探针和捕获探针：所述的信号产生探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA-1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，DNA-3，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，DNA-5，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，DNA-7，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，DNA-9，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，DNA-11，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，DNA-13，其核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，DNA-15，其核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；所述的捕获探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA-2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，DNA-4，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，DNA-6，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，DNA-8，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，DNA-10，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，DNA-12，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，DNA-14，其核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。其中，信号产生探针的核苷酸序列优选DNA-11；捕获探针的核苷酸序列优选DNA-12。基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，包括信号产生探针和捕获探针，所述信号产生探针的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。其中，所述信号产生探针的5’端修饰FITC，所述捕获探针的3’端修饰纳米银探针。本专利技术通过对乳铁蛋白适配体进行截断，在不改变适配体高亲和力和特异性的前提下优化了适配体的结构。同时，捕获探针、信号产生探针可以分别结合到乳铁蛋白的两个位点。在该方法中，两段截断适配体分别修饰异硫氰酸荧光素(FITC)和银纳米粒子(Ag10NPs)，加入乳铁蛋白后三者组装成截断适配体-乳铁蛋白的复合物，缩短了Ag10NPs和FITC的空间距离。因此，Ag10NPs可以产生重量扩增效应和荧光表面增强效应，最终引起荧光偏振信号急剧增加。作为优选，所述的纳米银粒子为Ag10NPs。基于双信号放大的乳铁蛋白荧光偏振适配体传感器在检测阴性蛋白中的应用在本专利技术的保护范围之中。其中，所述的阴性蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA、酪蛋白、乳铁蛋白，优选乳铁蛋白。其中，检测时，激发波长为480nm，发射波长为528nm。有益效果：本专利技术以FITC标记的截断适配体为信号产生探针，以Ag10NPs修饰的截断适配体为捕获探针，通过乳铁蛋白与捕获探针、信号产生探针的特异性结合使荧光偏振信号发生改变，且乳铁蛋白浓度对数值与荧光偏振信号呈线性变化，从而实现对乳铁蛋白的定量检测。该种荧光偏振法灵敏度极高，抗干扰性非常强，可以快速高通量检测，并实现了复杂样品中乳铁蛋白的测量，该方法检测的线性范围为0.2ng/mL～25μg/mL，该传感器相对于传统的均相溶液检测限可以降低三个数量级，达到1.25pM。附图说明图1基于截断适配体和Ag10NPs双信号放大荧光偏振适配体传感器原理图；图2不同碱基数截断适配体荧光偏振信号图；图3截断适配体结构优化荧光偏振信号图；图4双结合位点验证荧光偏振信号图；图5Ag10NPs表面修饰探针数优化图(a)和Ag10NPs信号放大验证图(b)；图6截断适配体传感器对乳铁蛋白检测特异性检测图(a)和线性图(c)，A4适配体对乳铁蛋白线性检测图(b)；图7截断适配体传感器对奶粉样品实际检测图美赞臣(a)、贝因美(b)、康克莱加标法线性检测图(c)，三种奶粉样品实际检测表(d)；具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：最佳适配体截断位点分析将之前筛选出的适配体A4SEQIDNO.16：AGGCAGGACACCGTAACCGGTGCATCTATGGCTACTAGCTCTTCCTGCCT分别在15、25、35碱基处截断得到三组截断适配体：DNA-1(15碱基)和DNA-2(35碱基)、DNA-3(25碱基)和DNA-4(25碱基)、DNA-5(35碱基)和DNA-6(15碱基)。DNA-1、DNA-3和DNA-5均修饰FITC。将10μL、250μM三组截断适配体分别与1μg/mL乳铁蛋白标准样品混合，37℃下反应30min，用酶标仪检测，激发波长为480nm，发射波长为528nm，最终得到最佳截断适配体；图2为不同碱基数截断适配体荧光偏振信号图。由该图可知DNA-3和DNA-4信号最高，且明显高于完整适配体Lac-A4，背景也有一定的降低，因此选取截断适配体DNA-3和DNA-4做进一步研究。实施例2：截断适配体优化将得到的截断适配体结构不断优化。分别去掉截断适配体3、5、7对杂交碱基对得到三对截断适配体：DNA-7和DNA-8、DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，其特征在于，包括信号产生探针和捕获探针，所述的信号产生探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA‑1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA‑3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，DNA‑5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，DNA‑7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，DNA‑9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，DNA‑11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，DNA‑13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，DNA‑15，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述的捕获探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA‑2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，DNA‑4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，DNA‑6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，DNA‑8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，DNA‑10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，DNA‑12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，DNA‑14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。...

【技术特征摘要】
1.基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，其特征在于，包括信号产生探针和捕获探针，所述的信号产生探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA-1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，DNA-3，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，DNA-5，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，DNA-7，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，DNA-9，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，DNA-11，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，DNA-13，其核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，DNA-15，其核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；所述的捕获探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：DNA-2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，DNA-4，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，DNA-6，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，DNA-8，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，DNA-10，其核苷酸序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丹科，李慧，陈竹，刘晓辉，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32