一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，属于植物细胞遗传学技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，采用羟基脲和N

Method for inducing mitosis synchronization of spinach root tip cell

The invention discloses a method for inducing the synchronization of mitosis of root tip cells of spinach, belonging to the technical field of plant cytogenetics. The technological scheme of the present invention is a method of inducing spinach root cell mitotic synchronization, hydroxyurea and N

【技术实现步骤摘要】
一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法
本专利技术属于植物细胞遗传学
，具体涉及一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法。
技术介绍
染色体是细胞核中最重要的组成部分，染色体数目和结构的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源。根尖细胞有丝分裂中期制片是一项基本的细胞遗传学研究技术和手段，该技术以及以此技术为基础的核型分析和荧光原位杂交等技术在物种鉴定和鉴别、物种间亲缘关系确定、物种倍性鉴定和杂交育种等研究中有广泛的应用。菠菜是苋科藜亚科菠菜属1年生或2年生草本植物，其叶片富含铁、叶黄素、叶酸、维生素、矿物质以及抗氧化剂，是一种重要的经济类绿叶蔬菜。菠菜通常情况下为雌雄异株，但少数情况下也会出现雌雄同株。其遗传组成为2n=2x=12，性别由XY染色体决定。近年来，对菠菜的研究主要集中在营养成分、栽培及分子生物学等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于菠菜的细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。并且，尽管菠菜根尖的分生组织区分裂活动比较旺盛，但分裂中期的细胞仅占据很少一部分，大部分细胞仍处于间期，这为获得理想的染色体制片造成了很大障碍，往往需要进行大量的染色体制片，才能挑选出少量理想的可用于分析及后期实验的玻片，浪费大量的人力、物力和时间。诱导植物细胞周期同步化可以使处于分裂中期的细胞比例大大增加，使染色体制片的成功率和稳定性大大提高。但是对于菠菜，甚至苋科还没有相关的报道。目前最常用的方法是采用羟基脲（HU）和甲基氨草磷（APM）双阻断法诱导植物细胞有丝分裂同步化，可获得高频率有丝分裂中期指数。但是，HU和APM都有毒性，并且经APM处理后，菠菜根尖细胞染色体容易拖尾，形态不好，不利于进行后期的更深入的研究和分析。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于：采用羟基脲和N2O双阻断法诱导菠菜细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞。本专利技术所述的诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于具体步骤为：（1）根尖培养：将菠菜种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.5-1.5cm；（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为3mmol/L的羟基脲处理根长为0.5-1.5cm的菠菜种子18h；（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖6-8h；（4）N2O预处理：切取根尖放入N2O气室中处理1-3h；（5）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min。进一步优选，步骤（1）中菠菜根长优选为1cm。进一步优选，步骤（3）中清水培养根尖的时间优选为7h。进一步优选，步骤（4）中N2O的处理压强为1.01MPa，N2O的处理时间优选为2h。进一步优选，经过步骤（5）处理后，将固定好的根尖水洗后置于离析液中离析1.5min，该离析液是体积比为1:1的浓盐酸与无水乙醇的混合液，再水洗去除离析液后切下2mm长的根尖生长点部分放在载波片上，充分切碎后滴加改良品红染液染色15min，加上盖玻片进行常规压片，然后将玻片置于显微镜下观察，拍照并计算有丝分裂中期分裂相比例。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：1、使用HU可使细胞阻断在分裂间期，去除HU后进行恢复培养，可诱导细胞进行同步化，经过6-8h的恢复培养，使大量细胞位于细胞分裂的中期，经预处理、固定及压片后，有丝分裂中期细胞的比例大大增加；2、本专利技术采用N2O预处理根尖，可有助于去除细胞质背景，使染色体形态良好，且方法简单，另外，在制片过程中，可显著减少对环境和人体的污染和毒害风险；3、采用本专利技术可获得大量的菠菜中期分裂相，使菠菜染色体标本制备的成功率大大提高，节省大量的人力、物力和时间；4、采用本专利技术的方法可以为菠菜染色体标本的制备提供便利，对于菠菜染色体物理图谱构建、遗传育种、性染色体进化研究以及菠菜属植物的进化研究等具有重要的理论和实践价值。附图说明图1为菠菜根尖同步化后常规压片所观察到的细胞图；图2为菠菜根尖未同步化后常规压片所观察到的细胞图；图3为菠菜根尖同步化后滴片法所获得的染色体图；图4为45SrDNA在菠菜染色体上的定位图（A为DAPI复染的染色体，B为AlexaFluor-488荧光素标记的45SrDNA的信号位点，C为合成图）。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，包括以下步骤：1、根尖培养：将菠菜种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为1cm；2、羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为3mmol/L的羟基脲处理根长为1cm的菠菜种子18h；3、恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养种子7h；4、N2O预处理：切取根尖放入N2O气室中处理2h，该N2O气室内的压强为10atm（1.01MPa）；5、固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min；6、压片：将固定好的根尖水洗后放入离析液（体积比为1:1的浓盐酸和无水乙醇混合液）中离析1.5min，水洗去除离析液后切下2mm长的根尖生长点部分放在载玻片上，充分切碎后滴加改良品红染液染色15min，加上盖玻片进行常规压片；7、镜检：将玻片置于显微镜下观察，拍照并计算有丝分裂中期分裂相比例。采用该方法后，如图1所示，菠菜中期分裂相比例可以达到50%以上，而未经同步化，常规处理所得的菠菜中期分裂相比例约为1%（图2）。实施例2滴片法制备菠菜中期染色体标本将同步化处理后的菠菜根尖切取根尖分生组织区，置于20µL含质量体积分数为1%的果胶酶和质量体积分数为2%纤维素酶的混合液中，于37℃酶解2h。酶解完成后用体积分数为70%的乙醇洗根尖两次，然后在40μL乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μL无水乙酸，混匀后吸5-8μL滴片，室温放置5min后即可镜检。镜检良好的片子放紫外交联仪中经过120-125mJ/cm2处理2min固定染色体备用。镜检结果如图3所示，菠菜染色体分散良好，形态清晰，细胞质背景较低。实施例3菠菜中期染色体荧光原位杂交45S探针标记：将下列组分在冰上加入离心管中：玉米45SrDNA2µg，10×nicktranslationbuffer2µL，Labeled-dNTP（Texasred-dCTP或AlexaFluor-488-dUTP）0.5µL，Non-labeled-dNTPs2µL，DNApolymeraseI5µL，DNaseI0.5µL，用去离子水补至20µL。混匀后PCR仪中于15℃处理2h，加5×TAE+140ng/µL鲑精DNA175µL，加入体积分数90%乙醇-体积分数10%乙酸钠500µL，混匀沉淀探针2h以上，然后置于离心机中于13000rpm的离心速率离心30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于：采用羟基脲和N

【技术特征摘要】
1.一种诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于：采用羟基脲和N2O双阻断法诱导菠菜细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞。2.根据权利要求1所述的诱导菠菜根尖细胞有丝分裂同步化的方法，其特征在于具体步骤为：（1）根尖培养：将菠菜种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.5-1.5cm；（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为3mmol/L的羟基脲处理根长为0.5-1.5cm的菠菜种子18h；（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖6-8h；（4）N2O预处理：切取根尖放入N2O气室中处理1-3h；（5）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min。3.根据权利要求2所述的诱导菠菜根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李书粉，王冰肖，程广前，李莎，邓传良，高武军，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41