一种植物组织的显微观察方法技术

本发明专利技术公开了一种植物组织的显微观察方法。本发明专利技术提供的植物组织的显微观察方法，将固定处理后再使用氢氧化钾进行消化，再进行透明处理，避免了酶解或其它操作，节省了成本；透明效果好，与荧光染色和标记操作兼容性好：可通过荧光染色在荧光显微镜下清晰地观测到植物深层组织的内部结构。消化处理结合透明技术对植物深层组织进行显微观察的方法为高等植物表型鉴定以及基因表达模式的深入研究奠定了基础，尤其在植物深层组织结构进行观察的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。

【技术实现步骤摘要】
一种植物组织的显微观察方法
本专利技术涉及生物
,尤其涉及一种植物组织的显微观察方法。
技术介绍
随着功能基因组学、分子生物学研究的不断深入，特定基因在植物体内的表达部位其在特定发育时期的功能得到了广泛关注。荧光显微观察和三维成像技术为植物表型分析、植物与病原菌互作以及基因表达模式分析提供了重要工具。与动物细胞相比，植物细胞壁与细胞质折射率不同，而且细胞中含量丰富的色素和芳香类物质使获取的图像信噪比降低。因此，以往对植物细胞的显微观察仅限于深度大约为30μm左右的几层细胞，极大地影响了植物细胞结构和功能的解析。为了观察植物体更深层的内部结构或亚细胞结构，往往需要经过特殊处理，使植物样品减少厚度及体积，使光线透过样品才能进行显微观察。处理后的材料要求小而薄、完整、透明、保持原结构，又具有颜色容易辨认。为达到上述要求，需要采取不同的制片方法或者在成像之前对植物材料进行透明，以方便观察组织较厚的植物样品，例如烟草和番茄叶片、沙葱叶片等。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种植物组织显微镜检测前处理的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤A：1)将植物组织用固定液固定，得到固定后的植物组织；2)将所述固定后的植物组织用氢氧化钾消化，得到消化后的植物组织；3)将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤，得到洗涤后植物组织；4)将所述洗涤后植物组织在透明液中浸没处理，得到透明后的植物组织，实现植物组织显微镜检测前处理；所述PHEM溶液包括PIPES(对二氮己环-1,4-二(2-乙磺酸))、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、EGTA和MgCl2；所述透明液由尿素、丙三醇、TritonX-100和所述PHEM溶液组成；上述方法中，所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为40-80：15-35：5-15：1-3；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为60：25：15：2；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为60：25：10：2；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为40：15：5：1；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为4-8mol：20-40ml：0.05-0.15g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为6mol：20ml：0.1g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为6mol：30ml：0.1g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为4mol：20ml：0.1g。上述方法中，所述PHEM溶液由终浓度为40-80mMPIPES、终浓度为15-35mMHEPES、终浓度为5-15mMEGTA、终浓度为1-3mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为60mMPIPES、终浓度为25mMHEPES、终浓度为15mMEGTA、终浓度为2mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为60mMPIPES、终浓度为25mMHEPES、终浓度为10mMEGTA、终浓度为2mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为40mMPIPES、终浓度为15mMHEPES、终浓度为5mMEGTA、终浓度为1mMMgCl2和水组成；或所述透明液由终浓度为4-8M尿素、体积百分比20-40％丙三醇、质量百分含量0.05-0.15％TritonX-100和PHEM溶液组成；或所述透明液由终浓度为6M尿素、体积百分比20％丙三醇、体积百分比0.1％TritonX-100和PHEM溶液组成；或所述透明液由终浓度为6M尿素、体积百分比30％丙三醇、体积百分比0.1％TritonX-100和PHEM溶液组成；或所述透明液由终浓度为4M尿素、体积百分比20％丙三醇、体积百分比0.1％TritonX-100和PHEM溶液组成。上述方法中，所述PHEM溶液的pH值为6.9；上述方法中，所述将固定后的植物组织用氢氧化钾消化的方式为将固定后的植物组织浸在浓度为质量百分比10-15％的氢氧化钾水溶液中；或所述将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤的方式为将所述消化后的植物组织浸没在所述PHEM溶液中。上述方法中，所述固定采用的固定液由戊二醛、多聚甲醛和所述PHEM溶液组成，所述戊二醛和所述多聚甲醛的配比为4-8ml：4-8g；或所述固定液由体积百分含量为4-8％戊二醛、质量百分比为4-8％多聚甲醛和所述PHEM溶液组成。上述方法中，所述固定的温度为0-4℃，所述固定的时间为10-16小时；或所述消化的时间为6-8小时；或所述洗涤的方式为洗涤3-5次，每次5-10分钟；或所述浸没处理的时间为5-10，所述浸没处理的方式为每隔1天更换一次所述透明液。上述方法中，所述植物组织为长度为0.5-1cm2的植物叶片或0.5-1cm长的植物组织。本专利技术第二个目的是提供一种植物组织的显微观察方法。本专利技术提供的方法，包括上述步骤A。本专利技术第三个目的是提供一种植物组织显微镜检测的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的步骤A的所述PHEM溶液和/或所述透明液。本专利技术提供的植物组织的显微观察方法，其具有以下优点：1)操作简单、快速：缩短了酶解和透明等前期处理的时间；2)固定处理后再使用氢氧化钾进行消化，避免了酶解或其它操作，节省了成本；3)透明效果好，与荧光染色和标记操作兼容性好：可通过荧光染色在荧光显微镜下清晰地观测到植物深层组织的内部结构。实验证明，采用本专利技术提供的方法对植物组织进行显微观察，观察深度显著提高；纤维素酶等的用量减少，达到节省成本的目的；为深入研究植物基因表达模式和深层组织结构提供了重要工具。由此可见，消化处理结合透明技术对植物深层组织进行显微观察的方法为高等植物表型鉴定以及基因表达模式的深入研究奠定了基础，尤其在植物深层组织结构进行观察的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。附图说明图1为在荧光显微镜下观察到的拟南芥叶片中Remorin1.2蛋白的分布情况。图2为在普通光学显微镜下观察到的沙葱叶片中叶绿体的分布情况。图3为在荧光显微镜下观察到的烟草叶片中Remorin蛋白的分布情况。图4为对比例在荧光显微镜下观察到的烟草叶片情况。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量百分含量。实施例1、拟南芥叶片的透明处理及显微镜观测一、叶片的透明处理所需试剂固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液组成，其中戊二醛的体积百分比为4％，多聚甲醛的质量百分比为4％。PHEM溶液由终浓度为40mMPIPES、15mMHEPES、5mMEGTA、1mMMgCl2和水组成，pH值为6.9；透明液由终浓度为4M尿素、20％丙三醇(体积百分比)、体积百分比0.1％TritonX-100和PHEM溶液组成。二、拟南芥叶片的透明处理及显微镜观测1、拟南芥叶片的透明处理将拟南芥(哥伦比亚生态型)种子种植于1/2MS培养基上，0-4℃春化两天后，置23±2℃培养箱中萌发，五天后移至培养土中继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物组织显微镜检测前处理的方法，包括如下步骤A：1)将植物组织用固定液固定，得到固定后的植物组织；2)将所述固定后的植物组织用氢氧化钾消化，得到消化后的植物组织；3)将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤，得到洗涤后植物组织；4)将所述洗涤后植物组织在透明液中浸没处理，得到透明后的植物组织，实现植物组织显微镜检测前处理；所述PHEM溶液包括PIPES、HEPES、EGTA和MgCl

【技术特征摘要】
1.一种植物组织显微镜检测前处理的方法，包括如下步骤A：1)将植物组织用固定液固定，得到固定后的植物组织；2)将所述固定后的植物组织用氢氧化钾消化，得到消化后的植物组织；3)将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤，得到洗涤后植物组织；4)将所述洗涤后植物组织在透明液中浸没处理，得到透明后的植物组织，实现植物组织显微镜检测前处理；所述PHEM溶液包括PIPES、HEPES、EGTA和MgCl2；所述透明液由尿素、丙三醇、TritonX-100和所述PHEM溶液组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为40-80：15-35：5-15：1-3；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为60：25：15：2；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为60：25：10：2；或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl2的摩尔的量比为40：15：5：1；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为4-8mol：20-40ml：0.05-0.15g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为6mol：20ml：0.1g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为6mol：30ml：0.1g；或所述尿素、所述丙三醇、所述TritonX-10的配比为4mol：20ml：0.1g。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PHEM溶液由终浓度为40-80mMPIPES、终浓度为15-35mMHEPES、终浓度为5-15mMEGTA、终浓度为1-3mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为60mMPIPES、终浓度为25mMHEPES、终浓度为15mMEGTA、终浓度为2mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为60mMPIPES、终浓度为25mMHEPES、终浓度为10mMEGTA、终浓度为2mMMgCl2和水组成；或所述PHEM溶液由终浓度为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：田世平，陈彤，秦国政，徐勇，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11