寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的RT‑PCR检测方法、引物和探针及试剂盒技术

本发明专利技术涉及虫媒传染病的分子生物学检测技术领域，公开了寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT‑PCR检测方法、引物和探针及试剂盒。引物包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8的序列，探针包括SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9的序列。试剂盒包括：引物探针混合液、RT‑PCR反应液、酶混合液、阳性标准品。本发明专利技术通过优化反应液配方和引物探针序列，采用三重实时荧光RT‑PCR扩增技术可以在同一管反应液中快速检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅热病毒，而不需要分开单独检测，与传统PCR检测方法相比，减少了操作步骤，可以快速、准确检测出是否含有这三种病毒，缩短检测时间，提高检测效率，节省成本。

【技术实现步骤摘要】
寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的RT-PCR检测方法、引物和探针及试剂盒
本专利技术涉及虫媒传染病的分子生物学检测
，具体涉及寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT-PCR检测方法、引物和探针及试剂盒。
技术介绍
寨卡病毒病也称寨卡热（Zikafever），是由寨卡病毒（ZikaVirus，ZIKV）引起并通过蚊媒传播的一种病毒性疾病。寨卡病毒病发病症状：轻微发热、皮疹、结膜炎、肌肉和关节痛、全身乏力以及头痛等，这些症状通常持续2~7天。有研究显示寨卡病毒病可能会造成神经和自身免疫系统的并发症，如格林－巴利综合征（Guillian-Barrsyndrome），孕妇感染寨卡病毒则可能引起婴儿小头畸形。自2015年5月以来，巴西发现首例确诊寨卡病例后，全世界已有40多个国家150万余人感染寨卡病毒并引发其他多个国家输入性病例，我国北京市、广东省和台湾地区均有寨卡病毒感染的报道。登革热（Denguefever，DF）是由登革热病毒（Denguevirus，DENV）引起的一类急性传染病，该病主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，典型发病症状是发烧、头痛和关节痛等，严重状况下呈现出血和休克甚至致死现象。登革热是一种广泛流行于热带或亚热带地区的疾病，登革热病毒是小型黄病毒，在血清学上根据E蛋白抗原性不同分为I、I、II、III、IV型。据报道，近年来登革热出现多次暴发现象，相关统计数据显示：2014年马来西亚登革热病例已累计超六万例；2015年斯里兰卡共确诊近病例三万例，巴西共确诊病例七万多例，中国广东省确诊病例三万多例。基孔肯雅热（Chikungunyafever）是由基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CHIKV）引起的、经伊蚊传播的急性传染病，目前主要流行于东南亚和非洲地区。该病潜伏期一般为2~4天，也可长达7~12天。主要发病症状有：突然发热、寒战、躯干部皮疹、严重关节痛和头痛等，可伴有恶心，呕吐、畏光、结膜充血、腹痛或出血等。该病目前主要流行与印度洋地区，中国也有该病的疫情报道。目前，由于荧光RT-PCR技术具有特异型强、灵敏度高、重复性好、检测时间短和检测费用较低等优点，在临床大量样本检测时已被广泛使用。并且市面上已经开发出寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒相关的单重核酸检测试剂盒产品，但是对寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒三重核酸检测的产品还未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供特异性好、灵敏度高、能同时检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的引物和探针。本专利技术的另一目的是提供一种能够同时检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种能够同时检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的试剂盒。为达到上述目的之一，本专利技术采用以下技术方案：一种用于寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT-PCR检测的引物和探针，包括：两条检测寨卡病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；一条检测寨卡病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.3；两条检测登革热病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5；一条检测登革热病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.6；两条检测基孔肯雅热病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；一条检测基孔肯雅热病毒的探针，其碱基序列为SEQIDNo.9。进一步地，所述SEQIDNo.3的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.6的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.9的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步地，所述引物和探针还包括：两条检测内标的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；一条检测内标的探针，其碱基序列为SEQIDNo.12；所述SEQIDNo.12的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。一种用于寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT-PCR检测的试剂盒，包括：两条检测寨卡病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；一条检测寨卡病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.3；两条检测登革热病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5；一条检测登革热病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.6；两条检测基孔肯雅热病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；一条检测基孔肯雅热病毒的探针，其碱基序列为SEQIDNo.9。进一步地，所述SEQIDNo.3的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.6的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.9的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步地，所述试剂盒还包括：两条检测内标的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；一条检测内标的探针，其碱基序列为SEQIDNo.12；所述SEQIDNo.12的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。以上引物和探针组成引物探针混合液。进一步地，所述试剂盒还包括：RT-PCR反应液、酶混合液、阳性标准品。进一步地，所述RT-PCR反应液包括：RT-PCR缓冲液、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物以及PCR增强剂。优选地，所述PCR缓冲液包括Tris-HCl（pH8.0）、硫酸铵、氯化钾和TritonX-100。优选地，所述PCR增强剂选自四甲基氯化铵（Tetramethylammoniumchloride，TMAC）、肉碱（L-carnitine）、海藻糖（D-(+)-trehalose）和非离子去污剂NP-40中的一种或多种。进一步地，所述酶混合液包括TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂；所述阳性标准品为根据病毒基因保守序列合成的DNA分子片段。优选地，所述突变型TaqDNA聚合酶能够耐受高达5~10%的全血、0.2~0.4µg/mL腐殖酸，或2.6~5.2mM乳铁蛋白。进一步地，所述试剂盒还包括内标，内标为一种原核表达的MS2噬菌体外壳蛋白包装的RNA颗粒，RNA分子含有内标扩增所需的序列，序列的碱基组成为SEQNo.13。一种检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的方法，包括以下步骤：S1、样本处理：将采集的血清样本，提取样本的基因组RNA，备用；S2、扩增试剂准备：13μLRT-PCR反应液、3μL酶混合液、4μL引物探针混合液、5μL样本溶液，反应体系总体积为25μL；S3、RT-PCR扩增程序：55℃，30min；95℃，3min；（95℃，10s；55℃，25s）×45个循环；S4、结果判定。所述结果判定具体是：FAM，ROX，CY5通道均无扩增曲线，HEX通道Ct值≤35.0，结果判定为阴性；ROX通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本寨卡病毒为阳性；FAM通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本登革热病毒阳性；CY5通道Ct值本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT‑PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括：两条检测寨卡病毒的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；一条检测寨卡病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQ ID No.3；两条检测登革热病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No.5；一条检测登革热病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQ ID No.6；两条检测基孔肯雅热病毒的引物，其碱基序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；一条检测基孔肯雅热病毒的探针，其碱基序列为SEQ ID No.9。

【技术特征摘要】
1.一种用于寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT-PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括：两条检测寨卡病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；一条检测寨卡病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.3；两条检测登革热病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5；一条检测登革热病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.6；两条检测基孔肯雅热病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；一条检测基孔肯雅热病毒的探针，其碱基序列为SEQIDNo.9。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述SEQIDNo.3的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.6的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述SEQIDNo.9的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括：两条检测内标的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；一条检测内标的探针，其碱基序列为SEQIDNo.12；所述SEQIDNo.12的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。4.一种用于寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒的三重实时荧光RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：两条检测寨卡病毒的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；一条检测寨卡病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.3；两条检测登革热病毒通用型的引物，其碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5；一条检测登革热病毒通用型的探针，其碱基序列为SEQIDNo.6；两条检测基...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟建新，吴德，曾华书，张利，吴晓卫，钟文杨，潘艳萍，
申请(专利权)人：深圳澳东检验检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44