一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法。提取水产养殖动物组织的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用溶藻弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的溶藻弧菌特异性引物是针对菌种溶藻弧菌的topA基因的特异性引物P1、toxR基因的特异性引物P2、toxR基因的特异性引物P3；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被溶藻弧菌感染。本发明专利技术使得水产养殖动物体内残留溶藻弧菌的检测更为简便，为今后水产养殖动物体内残留溶藻弧菌检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，同时为我国水产品病原菌检测和我国食品进出口安全奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法
本专利技术属于病原微生物检测领域，具体的涉及一种养殖水产动物中常见的病原菌：溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的PCR检测方法。
技术介绍
溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一种革兰氏阴性的嗜盐弧菌，在海水、海产品和食物中的检出率较高，其为海洋中正常菌群之一，存在于多种海洋动物中，是鱼虾贝等海水养殖动物的条件致病菌，对水产养殖业造成巨大的经济损失。溶藻弧菌也能引起人体伤口感染和败血症。近年来，溶藻弧菌引起食物中毒和胃肠炎的报道屡见不鲜，症状主要表现为不同程度的头痛、头晕、乏力、腹痛、恶心等消化道症状。因此，溶藻弧菌作为一种致腹泻菌和影响食品安全的病原菌日益受到重视。目前国内外对溶藻弧菌检测方法主要有细菌生化方法、免疫学检测方法、变性高效液相色谱、环介导恒温扩增技术、分子生物检测法。但存在着检测方法复杂，灵敏性差等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水产养殖动物中溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的PCR检测方法。本专利技术的方法可快速鉴定致病源，为我国水产养殖动物的安全和水产食品进出口安全提供技术支持。本专利技术采用的技术方案是：一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用溶藻弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的溶藻弧菌特异性引物是针对溶藻弧菌的topA基因的特异性引物P1、toxR基因的特异性引物P2、toxR基因的特异性引物P3；所述的特异性引物P1的序列为：P1-F:TCGCTTCATGGACCGTGTC；P1-R:GGCGCTTAGGTTAGTCGAGT。所述的特异性引物P2的序列为：P2-F:CTGACGTTGAAGAAGCCACTT；P2-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT。所述的特异性引物P3的序列为：P3-F:CCTAAACGCGGTTATCAACTCA；P3-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT。PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃30s，60℃或69℃30s，72℃30s；30循环；第三阶段：72℃5min；第四阶段：4℃保存。3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被溶藻弧菌感染。判断标准为：针对特异性引物P1，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有484bp条带产生，则水产养殖动物被溶藻弧菌感染，否则没有被感染。针对特异性引物P2，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有286bp条带产生，则大菱鲆被溶藻弧菌感染，否则没有被感染。针对特异性引物P3，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有353bp条带产生，则海参被溶藻弧菌感染，否则没有被感染。上述的一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，所述的水产养殖动物为大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾或三文鱼。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术，设计的溶藻弧菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出溶藻弧菌，表现出很强的特异性。2.本专利技术，设计的溶藻弧菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖水产品动物体内残留的溶藻弧菌，其最低检测浓度可达到10-5ng/ul。3.本专利技术，所提供的水产养殖动物体内残留溶藻弧菌的PCR检测方法，使得水产养殖动物体内残留溶藻弧菌检测更为简便。在水产养殖动物中，一旦存在病原菌溶藻弧菌，即能够做到快速鉴定，为我国水产品进出口提供有效的检查方法。4.本专利技术的检测方法可有效检出水产养殖动物体内的高危致病菌溶藻弧菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后水产养殖动物体内残留病原菌溶藻弧菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为我国水产品进出口食品安全提供技术支持，同时为我国养殖水产品食品安全健康发展做出了贡献。附图说明图1是实施例1溶藻弧菌特异性引物P1的PCR反应条件优化；其中，M:MarkerD，1-5:退火温度分别为65℃，66℃，67℃，68℃，69℃。图2是实施例1溶藻弧菌特异性引物P1的特异性验证；其中，1.Vibriofurnissi；2.Vibriovulnificus；3.Vibriohollisae；4.Vibrioparahemolyticus5.Vibrioharveyi；6.Vibriofluvialis；7.Vibriocampbellii；8.Vibrioalginolyticus；9.Vibriometschnikovii；10.Vibriomimicus；11.Vibriocyclitrophicus；12.Aeromonashydrophila；13.Aeromonassalmonicida；14.Aeromonassobria15.Aeromonasveronii16.Pseudomonashelmanticensis；17.Pseudomonasaeruginosa；18.Pseudomonaskilonensis，M:MarkerD。图3是实施例1溶藻弧菌特异性引物P1的PCR反应灵敏性验证。其中，M:MarkerD，1-7:模板浓度分别为101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。图4是实施例1溶藻弧菌特异性引物P1对不同水产养殖动物PCR扩增产物的凝胶成像结果；其中，M:MarkerD，1-7分别为注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。图5是实施例2溶藻弧菌特异性引物P2的PCR反应条件优化；其中，M:MarkerDL2000，1-5:退火温度分别为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。图6是实施例2溶藻弧菌特异性引物P2的特异性验证；其中，1.Vibriofurnissi；2.Vibriovulnificus；3.Vibriohollisae；4.Vibrioparahemolyticus；5.Vibrioharveyi；6.Vibriofluvialis；7.Vibrioalginolyticus；8.Vibriocampbellii；9.Vibriometschnikovii；10.Vibriomimicus11.Vibriogigantis；12.Vibriocyclitrophicus；13.Aeromonashydrophila；14.Aeromonassalmonicida；15.Aeromonasveronii；16.Pseudomonashelmanticensis；17.Pseudomonasaeruginosa18.Pseudomonaskilonensis；19.Bordetellatrematum；M:MarkerDL2000。图7是实施例2溶藻弧菌特异性引物P2的PCR反应灵敏性验证。其中，M:MarkerD，1-7:模板浓度分别为102ng/ul，101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用溶藻弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的溶藻弧菌特异性引物是针对溶藻弧菌的topA基因的特异性引物P1、toxR基因的特异性引物P2、toxR基因的特异性引物P3；3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被溶藻弧菌感染。

【技术特征摘要】
1.一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用溶藻弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的溶藻弧菌特异性引物是针对溶藻弧菌的topA基因的特异性引物P1、toxR基因的特异性引物P2、toxR基因的特异性引物P3；3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被溶藻弧菌感染。2.根据权利要求1所述的一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：所述的溶藻弧菌是Vibrioalginolyticus。3.根据权利要求1所述的一种水产养殖动物体内溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于：所述的特异性引物P1的序列为：P1-F:TCGCTTCATGGACCGTGTCP1-R:GGCGCTTAGGTTAGTCGAGT所述的特异性引物P2的序列为：P2-F:CTGACGTTGAAGAAGCCACTTP2-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT所述的特异性引物P3的序列为：P3-F:CCTAAACGCGGTTATCAACTCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏生，张新刚，张力，艾海新，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21