一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱由8对SSR标记组成。构建方法包括：(1)菌丝培养；(2)基因组DNA的提取；(3)SSR分子标记的检测；(4)电泳检测。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇Cr62菌种。本发明专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，利用本发明专利技术构建的Cr62菌种SSR指纹图谱，在收集的40个历年来我国香菇主要栽培品种中具有专一性。

【技术实现步骤摘要】
一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
本专利技术属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
技术介绍
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2015年的766万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。面对这种局势，就需要进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。本专利技术的一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由8对SSR标记组成。SSR标记是基于香菇全基因组测序后开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增引物，经过对不同香菇品种进行PCR扩增后获得的多态性标记。SSR标记具有扩增带型好，重复性高的特点。本专利技术对大量的SSR引物进行了筛选，获得了8对多态性高的引物，用这8对引物组合获得的图谱带型，检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。表1SSR标记详细信息列表本专利技术的一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；(8)加入100μL1×TE(Tris/EDTA)缓冲液，使沉淀溶解；(9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL；PCR扩增得到的产物点样量为3μL。所述步骤(4)中的变性的具体工艺为：于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min。所述步骤(4)中的银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化，在高通量试验中较为高效实用。所述银染液的组成为1.5gAgNO3和1500mlH2O；显影液的组成为16gNaOH、1000mlH2O和8ml甲醛。本专利技术的一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的8对SSR引物，对扩增Cr62菌株的总DNA进行PCR扩增，Cr62菌种的扩增条带在收集的40份我国香菇主要栽培品种中具有专一性。表2为本专利技术使用的8对SSR引物在40份香菇品种中扩增出的所有等位片段的数量及编号(按照扩增片段从大到小编号，通过对照50bpladderDNAmarker确定各SSR引物扩增的各等位片段的相对分子量)。菌种Cr62使用这8对SSR引物的扩增片段在总等位片段中的编号组合为：(1+2)(4+5)(3+4+7)(1)(3)(1+3+4)(1+4)(1)，表3为菌种Cr62扩增片段组合的位置与大小。符合上述等位片段组合的菌种，即是香菇Cr62菌种。表2SSR引物扩增的所有等位片段信息汇总表表3菌种Cr62扩增的等位片段编号表有益效果本专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4d，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国40个香菇主栽菌种中具有Cr62菌种的专一性，具有良好的应用前景。附图说明图1为香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱，其中M是50bpDNAladder，数字代表的是所用的8对SSR引物，箭头所指的是香菇Cr62菌种的稳定且特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148‑1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192‑1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌种的带型编号组合为：(1+2)(4+5)(3+4+7)(1)(3)(1+3+4)(1+4)(1)。...

【技术特征摘要】
1.一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；所述菌种的带型编号组合为：(1+2)(4+5)(3+4+7)(1)(3)(1+3+4)(1+4)(1)。2.一种如权利要求1所述的香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。3.根据权利要求2所述的一种香菇Cr62菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，摇动...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海龙，章炉军，张美彦，周峰，李玉，谭琦，尚晓冬，宋春艳，姜宁，董慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31