哈蟆油药材DNA条形码鉴定PCR扩增引物及扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种用于哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物，该引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供了一种获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法，采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性1分钟，50℃‑54℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。采用本发明专利技术的PCR扩增引物及扩增方法，其PCR扩增特异性强，能快速有效的获得哈蟆油药材DNA条形码，使利用DNA条形码技术进行哈蟆油药材及基原动物鉴定成为可能。

【技术实现步骤摘要】
哈蟆油药材DNA条形码鉴定PCR扩增引物及扩增方法
本专利技术涉及中药基原物种鉴定
，具体涉及一种哈蟆油药材及其基原动物鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。
技术介绍
中药鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础。中药四大传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法主要依据性状特征差异进行鉴定，这些性状特征是与物种的不同发育阶段和环境紧密相关的表现型，易受环境饰变和知识经验影响。而基因组DNA序列由物种的遗传基础决定，也是不同生物的不可变“身份证”，这为动植物分类和鉴定提供了本质依据。DNA条形码(DNAbarcoding)技术是通过PCR技术扩增基因组序列中一段通用DNA片段，对PCR扩增的通用DNA片段进行比较分析完成物种快速、准确的识别和鉴定。当前中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已经纳入2010版、2015版中国药典，该指导原则规定动物类中药材采用细胞色素C氧化酶亚基(COI)为主体序列，利用PCR通用引物(LCO1490和HCO2198)进行扩增反应，将扩增序列测序后进行数据库比对，从而确定动物药材基原物种。但是，现在的通用引物及鉴定方法在哈蟆油药材鉴定中的使用效果并不好，非特异扩增较多，无法进行测序。因此，本领域技术人员想要开发一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。
技术实现思路
为了解决COI通用引物在哈蟆油药材DNA条形码鉴定中存在非特异扩增的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。本专利技术的一个方面提供了一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的扩增引物。在一个具体实施方式中，该扩增引物对的正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术的另一个方面还提供了一种获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法。在本专利技术的一个具体实施方式中，该扩增方法采用如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物进行PCR扩增。进一步地，上述PCR扩增的退火温度为50℃-54℃。进一步地，上述PCR扩增的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性1分钟，50℃-54℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。优选地，上述PCR扩增的退火温度为54℃。本专利技术的优势在于，使用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的扩增引物，并结合50℃-54℃退火的PCR反应条件，尤其是54℃的退火温度，能够对样品DNA进行特异性的扩增，从DNA电泳结果可以得到单一扩增条带。基于上述引物及扩增方法，能快速有效的获得哈蟆油药材DNA条形码，使利用DNA条形码技术进行哈蟆油药材基原动物鉴定成为可能。附图说明图1是本专利技术一个实施例的退火温度筛选电泳图；其中，泳道1为DL2000Marker；泳道2和11为阴性对照；泳道3-10为样品LWY1，退火温度分别为60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52.0℃、50.7℃和50℃(自左及右)；泳道12-19为样品LWY7，退火温度分别为60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52.0℃、50.7℃和50℃(自左及右)。图2是本专利技术一个实施例中进行PCR扩增方法验证的DNA电泳图；其中，泳道1为DL2000Marker；泳道2-17为LWY1-16号样品，泳道18为阴性对照。图3是本专利技术一个实施例中样品LWY1的PCR结果的部分测序峰图(含正反向测序结果)。图4是采用2015版中国药典中的COI通用引物进行PCR扩增后的结果图。其中，泳道1为DL2000Marker；泳道2-17为LWY1-16号样品，泳道18为阴性对照。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本专利技术的保护范围。以下具体实施方式中使用的PCR试剂为PC56-KODDNAPolymerase(购自北京艾德莱生物科技有限公司)。其他试剂若无特殊说明，均可直接购买获得。实施例1哈蟆油药材DNA条形码鉴定的COI引物设计哈蟆油的基原动物为蛙科(Ranidae)林蛙属的中国林蛙，因此选取GenBank中蛙科的所有全长COI序列，通过序列比对，设计与通用引物(LCO1490和HCO2198)扩增区域大致相同的引物，以确保条形码数据之间的可比性。由于蛙科动物不同属间的COI序列差异较大，因此，在设计能通用的扩增引物时具有较大的困难，故通过简并引物的方式，即在引物的3’端引入简并碱基，最终设计了适合于哈蟆油药材的COI条形码扩增的PCR引物，具体如下：正向引物LWF01(SEQIDNo.1)：5’-TCTCTACTAATCATAAAGAYATYGG-3’；反向引物LWR01(SEQIDNo.2)：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAARAATCA-3’；其中，R代表可以是A或G；Y代表可以是C或者T。实施例2哈蟆油药材COI条形码扩增方法的确定购买了13批次哈蟆油药材样品和3批次哈蟆油标准对照药材样品，基原物种均为中国林蛙RanatemporariachensinensisDavid。具体的：LWY1-12，LWY14：13批次哈蟆油药材；LWY13，LWY15-16：中国食品药品检定研究院标准对照哈蟆油药材。选择LWY1和LWY7哈蟆油药材样品进行本实施例的实验。1.模板DNA准备取哈蟆油药材约5mg，置入2.0mL离心管，加入500μL含0.1％～2％盐酸的水对哈蟆油组织进行复性，使用研磨杵反复研磨30秒左右，至无明显颗粒并混匀。加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠的缓冲液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解样品，使用涡旋混合仪混匀30秒左右，56℃孵育至溶液澄清，每半小时颠倒混合样品2～3次，或者使用水浴振荡器。加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM已二胺四乙酸的缓冲液，涡旋混匀30秒。加入700μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温下以最高速度离心5分钟。小心将上清液转移至一新的离心管，加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温下以最高速度离心5分钟。加入等体积无水乙醇，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30秒，室温下静置2～5分钟。小心将上清液转移至一新的离心管，加入1/10体积的3mol/LPH5.2的乙酸钠，在涡旋混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀。加入2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇或等体积异丙醇，在涡旋混合器上振荡混匀，冰浴5分钟，室温下以最高速度离心5分钟。弃去上清，加入1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀1～2次。沉淀在真空干燥器或者真空旋转蒸发器中干燥，或者小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，常温自然干燥。加入50μLddH2O溶解，获得模版DNA，在4℃或-20℃保存备用。采用上述方法提取哈蟆油DNA，避免了哈蟆油药材的高度膨胀，且获得的模版DNA纯度较高。2.PCR反应体系(以25μL为参照)2×TaqPCRMix：12.50μL正向引物：1.00μL反向引物：1.00μLddH2O$：8.50μL模本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，所述引物的反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQIDNo.1所示，所述引物的反向引物序列如SEQIDNo.2所示。2.一种获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法采用如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物进行PCR扩增。3.如权利要求2所述的获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：石林春，唐先明，宋经元，刘金欣，刘景波，何志一，姚辉，刘建辉，刘相辉，于海龙，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，哈尔滨市食品药品检验检测中心，
类型：发明
国别省市：北京,11