应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，具体步骤为：提取尿液中的DNA模板；制备ddPCR反应液；制备微滴；PCR扩増；检测微滴；分析数据以及显示结果；裂解液的组分构成为：10mM Tris‑HCl，1mM  EDTA,0.5% SDS，检测的热循环模式为：95 ℃孵育10min；95℃15s，63℃孵育1min，共45个循环；最后置于4 ℃中。本发明专利技术将ARMS和数字PCR结合起来，通过检测患者尿液中EGFR突变情况，解决了现有技术中对结直肠癌患者进行EGFR基因突变检测时繁琐、费时和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性检测。

【技术实现步骤摘要】
应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法
本专利技术涉及结直肠癌检测
，具体来说是一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法。
技术介绍
据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告，我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位，病死率分别居第4位和第5位，我国结直肠癌的发病率亦呈逐年上升趋势，手术仍是治疗结直肠癌的主要手段，但效果并不理想。表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生，EGFR存在于大多数细胞中，在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等，其中在结直肠癌的阳性表达率为25%〜77%。近年来，应用靶向药物治疗癌症取得了重要进展，已证实EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TyrosineKinaseInhibitors,EGFR-TKIs）在EGFR突变的肺癌患者治疗中取得确切的疗效，因此，在目前抗肿瘤分子靶向治疗中，EGFR成为靶向药物治疗结直肠癌最受关注的治疗靶点之一.EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，突变率最高的是19外显子的2种缺失突变（delE746-A750)和21外显子的点突变（L858R)，研究显示二者在所有EGFR基因突变中的比例占90%以上，其中，外显子21上的L858R点突变通常是替代突变，2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸(CTG—CGG)，因此EGFR外显子21L858R点突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考，同时可用于癌症患者用药期间耐药性突变监测。在结直肠癌患者中，EGFR基因突变率较高，具有重要的研究意义，但是，如何准确而有效的检测EGFR突变状态仍是一个迫切需要解决的问题，在目前诊断检测中，样本来源和检测方法是主要限制方向，现在普遍通过侵入式活组织检查法确诊，价格昂贵、复杂，既费时又费力，不能及时检查或不便多次检测，而检测方法中，PCR产物测序法虽然是公认的检测标准，但是灵敏度并不高；PCR-RFLP可用于检测基因多态性，虽然灵敏，但是由于其设计操作复杂费时，使用起来受限制；变性高效液相色谱（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC）具有灵敏度高，检测快，高通量，且操作自动化的优点，但是由于其对检测类型有一点的选择，且成本较高，使用起来很受限制，因此，缺少一种低成本、无创、易操作且特异性高的EGFR突变检测方法。ARMS法又称突变扩增阻滞系统，是以TaqDNA聚合酶缺少3`-5`外切酶活性，不能修复扩增时引物3`末端单个碱基的错配为基础，引物的3`端碱基与位点等位基因互补时，则继续扩增，当引物3`端碱基与位点等位基因错配时，则扩增停止或者是效率严重下降，ARMS-PCR方法灵敏度不足以对血液、尿液等体液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。1999年Vogelstein和Kinzler首次提出了"数字PCR(digitalPCR,dPCR)"的概念，dPCR具有极高的检测敏感性，且具有不易被PCR反应抑制剂干扰等特点，目前，dPCR技术以其极高的敏感性、绝对计数能力和无需定标等特性而在肿瘤分子诊断工作中得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中的检测精确度差、灵敏度不足的缺陷，提供一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法来解决上述问题。本专利技术公开了一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，具体步骤为：步骤一、提取尿液中的DNA模板：a、收集40ml尿液样本，在4℃、5000rpm的条件下离心10min，离心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5mlTE缓冲液，加入到步骤a收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5mlTE缓冲液，加入到步骤b收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10ul蛋白酶K加入到步骤c收集的沉淀内，在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到溶液；e、将溶液取出，冷却至室温后，向溶液内加入等体积的饱和酚，混合均匀后，在5000rpm的条件下离心10min，离心完成后，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，在5000rpm的条件下，离心10min，弃上清，得到混合液；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、加入500μL70%的乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μLTE缓冲液，即完成了对尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备ddPCR反应液：室温条件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探针，并制备10x引物/blocker/TaqMan-MGB引物预混液，其中，PCR上下游引物和blocker的浓度均为0.9μmol/L，TaqMan探针的浓度为0.2μmol/L，之后，将引物预混液、DNA模板、ddPCRSuperMix（BioRad）配置成20μLddPCR反应液，反应液的构成如下表所示：；步骤三、制备微滴：将配好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，将微滴发生板装入到QX100八通道微滴发生器，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴；步骤四、PCR扩増：将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于PCR仪中进行PCR扩増；步骤五、检测微滴：PCR扩增后，将96孔PCR板置于QX100微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；步骤六、分析数据以及显示结果：采用QuantaSoft软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性。作为优选，所述的裂解液的组分构成为：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作为优选，所述的步骤二中，所述的引物预混液中，引物序列如下：正向引物序列F:5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`反向引物序列R:5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`TaqMan-MGB探针序列：5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`Blocker序列:5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`。作为优选，所述的步骤四中，检测的热循环模式为：95℃孵育10min；95℃15s，63℃孵育1min，共4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、提取尿液中的DNA模板：收集40ml尿液样本，在4℃、5000rpm 的条件下离心 10min，离心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤a收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤b收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10 ul蛋白酶K加入到步骤c收集的沉淀内， 在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到溶液；e、将溶液取出，冷却至室温后，向溶液内加入等体积的饱和酚，混合均匀后，在5000 rpm的条件下离心10 min，离心完成后，弃上清； f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，在5000 rpm的条件下，离心10 min，弃上清，得到混合液；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇，混合均匀后，在‑20℃ 的条件下放置1h后，10000 rpm离心15min，弃上清；h、加入500μL 70%的乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μL TE缓冲液，即完成了对尿液中 DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备ddPCR反应液：室温条件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探针，并制备10x引物/ blocker/ TaqMan‑MGB 引物预混液，其中，PCR上下游引物和blocker的浓度均为0.9 μmol/L，TaqMan探针的浓度为0.2 μmol/L，之后，将引物预混液、DNA模板、ddPCR SuperMix（Bio Rad）配置成20 μL ddPCR反应液，反应液的构成如下表所示：...

【技术特征摘要】
1.一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、提取尿液中的DNA模板：收集40ml尿液样本，在4℃、5000rpm的条件下离心10min，离心完成后收集底部的沉淀；b、取1.5mlTE缓冲液，加入到步骤a收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；c、另取1.5mlTE缓冲液，加入到步骤b收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；d、取500ul裂解液和10ul蛋白酶K加入到步骤c收集的沉淀内，在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到溶液；e、将溶液取出，冷却至室温后，向溶液内加入等体积的饱和酚，混合均匀后，在5000rpm的条件下离心10min，离心完成后，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，在5000rpm的条件下，离心10min，弃上清，得到混合液；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、加入500μL70%的乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μLTE缓冲液，即完成了对尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备ddPCR反应液：室温条件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探针，并制备10x引物/blocker/TaqMan-MGB引物预混液，其中，PCR上下游引物和blocker的浓度均为0.9μmol/L，TaqMan探针的浓度为0.2μmol/L，之后，将引物预混液、DNA模板、ddPCRSuperMix（BioRad）配置成20μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，李静，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34