【技术实现步骤摘要】
一种检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
,具体涉及一种基于IonProton测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法及试剂。
技术介绍
作为最常见的消化道恶性肿瘤结直肠癌,其发病率位居全球恶性肿瘤的第三位,死亡率位居第四位。全球每年超过一百万新发结直肠癌病例,且发病率位居男性恶性肿瘤的第三位,女性恶性肿瘤的第二位。结直肠癌发病率与死亡率在经济发达的国家和地区高于欠发达国家和地区,男女发病地域分布趋势一致,但男性高于女性。随着年龄的增长,结直肠癌发病和死亡的危险性增加。全球结直肠癌的发病率和死亡率总体仍呈上升趋势。结直肠癌年龄组别发病率整体的趋势是发达国家结直肠癌发病较发展中国家晚。近年来我国经济发展和城市化加快,居民生活习惯及饮食习惯较以前有明显改变,加之我国人口逐渐老龄化,结直肠癌的发病率及死亡率均出现明显上升趋势,且高于世界平均水平,结直肠癌的预防和治疗已刻不容缓。RAS家族由KRAS、HRAS和NRAS组成,基因家族各成员间同源性可达85%。RAS基因编码p21蛋白,分子量为21kD,位于细胞膜的内表面,具有GTP酶活性,参与传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态,失活状态为GDP结合状态,其转变为活性致癌基因的主要方式是第12、13和61密码子的突变,其中以第12密码子点突变最常见。KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因,该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤,在结直肠癌患者中为20%~50%。KRAS为EGFR信号传导通路RAS-RAF- ...
【技术保护点】
一种检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法及试剂盒,其特征在于该方法基于高通量测序技术,同时检测人类结直肠癌相关的4种常见基因,分别是KRAS基因第2、3、4号外显子上的19个突变;NRAS基因第2、3号外显子上的5个突变;BRAF基因第15号外显子上的3个突变和PIK3CA基因第10、21号外显子上的5个突变;所述人类结直肠癌4个基因的突变型别分别为如下:
【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法及试剂盒,其特征在于该方法基于高通量测序技术,同时检测人类结直肠癌相关的4种常见基因,分别是KRAS基因第2、3、4号外显子上的19个突变;NRAS基因第2、3号外显子上的5个突变;BRAF基因第15号外显子上的3个突变和PIK3CA基因第10、21号外显子上的5个突变;所述人类结直肠癌4个基因的突变型别分别为如下:且所述试剂盒试剂成分包括:DNAPCR反应液、DNAPCR引物、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头序列、特异性接头1-16序列、文库扩增反应液、文库扩增引物、磁珠、75%乙醇和无核酸酶水。2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征还在于包括以下步骤:(1)样本DNA提取:对石蜡包埋组织样本进行DNA提取,得到待测样本DNA;(2)目的片段扩增:分别设计KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因型别的扩增引物对和待检测样本DNA、PCR反应液、无核酸酶水混合,经多重PCR反应,得到目的基因DNA片段;(3)消化引物序列:将步骤(2)得到的目的基因DNA片段与引物消化液混合反应,得到去引物的平末端目的基因DNA片段;(4)接头连接:将步骤(3)得到的平末端目的基因DNA片段与连接缓冲液、P1接头、特异性接头1-16、DNA连接酶和无核酸酶水混合后进行连接反应,得到加接头的DNA片段;(5)文库扩增及纯化:用磁珠通过对步骤(4)得到的接头DNA片段进行纯化,去除多余的小片段接头,得到纯化后加接头的DNA片段;然后加入文库扩增引物及文库扩增反应液对纯化后加接头的DNA片段进行PCR扩增,最后用磁珠对扩增的产物进行纯化,去除多余的大片段和小片段,得到最终的文库;(6)文库质检:将步骤(5)得到的文库采用Qubit3.0测出浓度,再将其稀释到200pmol/L,最后采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度,得出测序文库;(7)进行模板制备和富集:将步骤(6)得到的测序文库进行乳液PCR进行扩增,得到上机模板;再通过磁珠进行富集纯化,得到上机模板;(8)上机测序:将步骤(7)得到的上机模板进行上机测序;(9)数据分析:通过对数据的分析,分别确定KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因型别。3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征还在于步骤(2)所述扩增引物分别为:4.根据权利要求2所述检测方法,其特征还在于,步骤(4)中的P1接头序列为:5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’5.根据权利要求2所述检测方法,其特征还在于,步骤(4)中的特异性接头序列是由如下正反两个序列组成的特异性接头x:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’;特异性接头x代表的序列具体如下:特异性接头1:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’;特异性接头2:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’5’-ATCGTTCTCCTTA...
【专利技术属性】
技术研发人员:李明,杨学习,吴英松,王庆,刘志鹏,
申请(专利权)人:广州市达瑞生物技术股份有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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