一种大豆基因拷贝数变异分析方法技术

本发明专利技术提供一种大豆基因拷贝数变异分析方法，包括以下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化；2)被测基因引物设计；3)以β‑actin为内参基因，用内参基因引物与步骤2)涉及的被测基因引物分别对基因组DNA模板进行荧光定量PCR反应；4)利用RT‑qPCR获得被测基因和内参基因β‑actin的Ct值计算被测基因在不同大豆品种中的相对丰度值，通过被测基因在不同大豆品种中的相对丰度值之间的比值判断被测基因在不同品种大豆中的拷贝数变异关系。本方法基因组DNA用量较高通量测序、微阵列法和原位杂交技术用量少10

【技术实现步骤摘要】
一种大豆基因拷贝数变异分析方法
本专利技术涉及遗传育种
，具体涉及基因拷贝数变异研究方法。
技术介绍
拷贝数变异(copynumbervariants，CNVs)是生物基因组中一种重要的遗传变异形式。研究发现CNVs与作物的许多性状相关，Cook等(2012)研究发现大豆胞囊线虫抗病位点Rhg1作用机制为31kbp基因组片段的拷贝数变异。因此研究作物种质资源个体表型差异、群体拷贝数表型变异规律以及基因组进化具有重要意义。目前拷贝数变异的检测技术包括微阵列比较基因杂交(array-basedcomparativegenomichybridization，aCGH)、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)、芯片代表性寡核苷酸微阵列分析(respectivelyoligonucleotidemicroarrayanalysis，ROMA)、多重连接探针扩增(multiplexligation.dependentprobeamplification；MLPA)、多重可扩增探针杂交(multiplexamplifiableprobehybridization，MAPH)、新一代测序技术以及荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，FISH)检测等，虽然CNV检测技术较多，其主要用于人类疾病的检测，针对于作物的研究，受到每种方法的技术手段、成本及操作难度的限制难于在常规分子实验室中推广应用，尤其当被测样本容量大的情况下，如进行作物重组群体的表型检测难度很大。目前拷贝数变异的检测技术包括微阵列比较基因杂交(array-basedcomparativegenomichybridization，aCGH)、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)、芯片代表性寡核苷酸微阵列分析(respectivelyoligonucleotidemicroarrayanalysis，ROMA)、多重连接探针扩增(multiplexligation.dependentprobeamplification；MLPA)、多重可扩增探针杂交(multiplexamplifiableprobehybridization，MAPH)、新一代测序技术以及荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，FISH)检测，以上检测方法存在明显的不足之处，难于在常规分子实验室中广泛应用，其中aCGH、ROMA、MLPA和MAPH等方法对芯片及杂交探针的需求及探针回收率低、实验成本高等问题；新一代测序技术对CNV的检测因高测序深度而导致高成本及对大样本群体CNV分析的限制；FISH技术检测价格昂贵，且对研究人员操作手法和分析经验要求极高，无法进行大规模重复性分析且周期长、不适合做大样本分析。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种大豆基因拷贝数变异分析方法，具体方案包括如下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化：采取SDS法提取大豆基因组DNA，将基因组DNA浓度调整为50ng/L，-20℃保存备用。2)被测基因引物设计：设计被测基因引物，设计模板为被测基因CDS序列；3)RT-qPCR：以β-actin为内参基因，用内参基因引物与步骤2)涉及的被测基因引物分别对基因组DNA模板进行荧光定量PCR反应；荧光定量PCR检测方法反应体系为20μL，包括：2×荧光定量预混试剂(SuperRealPreMixPlus(2×))10.0μl，浓度为10μmol·L-1的PCR上下游引物各0.6μL，基因组DNA模板2μl，灭菌蒸馏水6.8μl；PCR程序包括：预变性95℃、15min；变性95℃、10s，退火55-60℃、20s，延伸72℃、20s,40个循环；内参引物：上游：5’GATCTACCATGTTCCCAAGT3’，下游：5’ATAGAGCCACCAATCCAGAC3’；4)利用RT-qPCR获得被测基因和内参基因β-actin的Ct值计算被测基因在不同大豆品种中的相对丰度值，通过被测基因在不同品种大豆中的相对丰度值之间的比值判断被测基因在不同品种大豆中的拷贝数变异关系。上述方法具体包括以下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化：采取SDS法提取品种A大豆基因组DNA，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测和Lite紫外分光光度计联合检测DNA浓度并通过稀释实现浓度均一化，将基因组DNA浓度调整为50ng/L，-20℃保存备用。2)被测基因引物设计：设计被测基因引物，设计模板为被测基因CDS序列；3)RT-qPCR：以β-actin为内参基因，用内参基因引物与步骤2)涉及的被测基因引物分别对基因组DNA模板进行荧光定量PCR反应；荧光定量PCR检测方法反应体系为20μL，包括：2×荧光定量预混试剂(SuperRealPreMixPlus(2×))10.0μl，浓度为10μmol·L-1的PCR上下游引物各0.6μL，基因组DNA模板2μl，灭菌蒸馏水6.8μl；PCR程序包括：预变性95℃、15min；变性95℃、10s，退火55-60℃、20s，延伸72℃、20s,40个循环；内参引物：上游：5’GATCTACCATGTTCCCAAGT3’，下游：5’ATAGAGCCACCAATCCAGAC3’；4)以RT-qPCR获得被测基因和内参基因β-actin的Ct值为基础数据，按公式2-(Ct(目的基因)-Ct(内参基因))计算被测基因相对丰度值，设被测基因相对丰度值为a；5)取品种B大豆，重复上述步骤1)-4)，设被测基因相对丰度值为b'；6)根据a/b的值判定被测基因在品种A中的拷贝数与被测基因在品种B中的拷贝数的多少：当a/b＞2.5时，被测基因在品种A中的拷贝数显著大于被测基因在品种B中的拷贝数。优选的，步骤2)所述引物设计遵循以下原则：a)PCR产物长度90bp-200bp；b)引物对在大豆基因组上具有唯一匹配位置。优选的，用Primer5.0软件设计引物，设计出的引物要以大豆基因组DNA为模板进行PCR扩增以测试基因引物特异性，以扩增产物唯一为准；并在退火温度55-60℃范围内进行温度梯度PCR确定引物的最佳退火温度，以扩增产物量最大为准；步骤3)中的退火温度选取步骤2)确定的最佳退火温度。上述引物设计遵循以下原则：(1)PCR产物长度90bp-200bp；(2)GC含量40％-60％；(3)避免形成发夹结构和引物二聚体；(4)产物避免跨内含子区；(5)引物设计完成后通过与大豆基因组序列的在线比对(www.phetozome.net)，确保引物对在大豆基因组上具有唯一匹配位置。上述步骤4)-6)中的数据处理方法为：以被测基因PCR产物相对丰度作为基因拷贝数变异基础数据，被测基因PCR产物相对丰度的计算采用内参基因法，具体通过公式2-ΔΔCt计算。其中ΔΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，对于相对定量ΔΔCt方法，Ct值是由三次试验重复取平均数得，相对拷贝数，即被测基因PCR产物相对丰度由2-ΔΔCt计算得到，利用不同品种的PCR产物相对丰度之间的倍数关系判断基因拷贝数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆基因拷贝数变异分析方法，其特征在于：包括以下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化：采取SDS法提取大豆基因组DNA，将基因组DNA浓度调整为50ng/μL，‑20℃保存备用；2)被测基因引物设计：设计被测基因引物，设计模板为被测基因CDS序列；3)RT‑qPCR：以β‑actin为内参基因；荧光定量PCR检测方法反应体系为20μL，包括：2×荧光定量预混试剂10.0μl，浓度为10μmol·L

【技术特征摘要】
1.一种大豆基因拷贝数变异分析方法，其特征在于：包括以下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化：采取SDS法提取大豆基因组DNA，将基因组DNA浓度调整为50ng/μL，-20℃保存备用；2)被测基因引物设计：设计被测基因引物，设计模板为被测基因CDS序列；3)RT-qPCR：以β-actin为内参基因；荧光定量PCR检测方法反应体系为20μL，包括：2×荧光定量预混试剂10.0μl，浓度为10μmol·L-1的PCR上下游引物各0.6μL，基因组DNA模板2μl，灭菌蒸馏水6.8μl；PCR程序包括：预变性95℃、15min；变性95℃、10s，退火55-60℃、20s，延伸72℃、20s，40个循环；4)利用RT-qPCR获得被测基因和内参基因β-actin的Ct值计算被测基因在不同大豆品种中的相对丰度值，计算公式为被测基因相对丰度值＝2-(Ct(目的基因)-Ct(内参基因))，通过被测基因在不同大豆品种中的相对丰度值之间的比值判断被测基因在不同品种大豆中的拷贝数变异关系。2.根据权利要求1所述的大豆基因拷贝数变异分析方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)基因组DNA的提取和浓度均一化：采取SDS法提取品种A大豆基因组DNA，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测和Lite紫外分光光度计联合检测DNA浓度并通过稀释实现浓度均一化，将基因组DNA浓度调整为50ng/μL，-20℃保存备用；2)被测基因引物设计：设计被测基因引物，设计模板为被测基因CDS序列；3)R...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雪，李冬梅，战宇航，朱治佳，韩英鹏，李文滨，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23