一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂技术

本发明专利技术公开了一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，所述方法包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中所述探针是双链寡核苷酸，所述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对所述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。本方法解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂
本专利技术涉及DNA检测
，尤其涉及一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂。
技术介绍
在科研、临床或健康体检等领域中进行基因检测时经常需要进行非伤害性取样，即通过获取人的毛发、指甲、粪便(含有肠道脱落细胞)、尿液、唾液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、呕吐物(含有消化道脱落细胞)、霉变生菌的组织或体液等复杂样本中对某一物种(通常是人)的特定DNA区域进行检测；在法医、刑侦等领域也时有发生样本保存不善或特定环境下取样的情况。这些样本成分往往及其复杂。从这些样本中提取的DNA往往含有大量的非目标物种DNA。例如，从粪便样本中提取的DNA是很多种DNA的混合物。其中大约60％的DNA来源于肠道细菌，剩余的绝大部分DNA来源于动物或植物食物残渣，可用于检测的结肠黏膜脱落细胞的DNA占总DNA的千分之一甚至更少。目前实验室常用的DNA检测方案如QPCR、时间飞行质谱、一代测序、高通量测序等都基于PCR(聚合酶链式反应)技术。而在大量的非目标物种DNA干扰存在的情况下，基于引物结合模板并延伸的PCR技术特异性会很差。从而导致以上常用的DNA检测方案会受到不同程度的影响。尤其在使用高通量测序技术对掺有大量混合物种DNA的痕量目标DNA进行目标区域测序时，需要投入大量的DNA样本，以保证痕量目标DNA有足够的拷贝数以对其准确检测。这时无用的其它物种DNA也越多，干扰作用也就越强。因此如何有效去除大量的非目标物种DNA的干扰并进行灵敏准确的特定DNA目标区域富集检测成为科研技术人员要解决的技术难题。目前现有的技术解决方案为在DNA抽提的过程中针对细菌等原核细胞和真核细胞的特性不同进行一定程度的区分。细菌等原核细胞较真核细胞不容易裂解，所以在抽提DNA时不进行加热裂解，而采用比较温和的裂解方案就可以减少总DNA中细菌DNA的含量。但实际自然环境下细菌自身就会裂解死亡并释放DNA，并且这种技术方案针对其它真核细胞DNA没有筛选去除作用，所以该方案效果往往不是很好。
技术实现思路
本专利技术提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中上述探针是双链寡核苷酸，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对上述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。进一步地，上述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。进一步地，上述探针带有亲和标记；优选地，上述亲和标记是位于上述探针两条链的5’端的生物素标记。进一步地，上述步骤(b)使用多条上述上游特异性引物组成的引物组和多条上述下游特异性引物组成的引物组。进一步地，上述探针长度为150-200bp。进一步地，每一个上述上游特异性引物和下游特异性引物距离上述待检测位点或待检测区域的距离为1-20个碱基，优选1-5个碱基。进一步地，上述待检测位点或待检测区域包括点突变、插入、缺失和基因融合中的至少一种。进一步地，上述方法还包括：(c)对上述步骤(b)的扩增产物进行测序，以检测上述待检测位点或待检测区域。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的试剂，包括：(a)探针，上述探针是双链寡核苷酸，用于对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)上游特异性引物和下游特异性引物，以及通用引物，用于对探针预富集产物进行特异性富集，以及对特异性富集产物进行通用引物扩增。进一步地，上述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。本专利技术的方法使用目标区域探针对DNA进行预富集，去除了绝大部分外源DNA和非目标区域DNA。该方法允许尽可能多地加入总DNA，进而增加目标痕量DNA的拷贝数。本专利技术使用双链探针对待检测目标区域的两条链都进行捕获，增加了痕量DNA的利用率。本专利技术还使用上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增，进一步降低了外源DNA和非目标区域DNA的含量，提高了痕量DNA的含量，解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。附图说明图1为本专利技术实施例中使用PCR的方法进行探针制作的原理示意图；图2为本专利技术实施例中使用双链DNA探针进行杂交预富集的原理示意图；图3为本专利技术实施例中对探针预富集产物进行特异性PCR富集及终文库构建的过程。图4为本专利技术实施例中构建的文库的电泳检测结果图，其中Library表示文库电泳结果，M表示Takara100bpMarker。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。目前传统的商业化探针制作为基因合成方法，该方法对探针长度有限制(一般100nt以上的探针合成准确度较差)，而且价格昂贵。而本专利技术使用PCR方法进行探针制作，不仅使探针成本极大降低，而且能够制作更长的特异性更好的探针。使用双链DNA探针进行杂交预富集，相较于传统的单链探针而言，可以同时富集目标区域的两条链，使富集效率和灵敏度更高。使用PCR的方法进行探针制作的原理，如图1所示，探针长度一般为150-200bp。探针两条链的5’端有生物素标记，以便使用亲和素进行捕获。探针是双链寡核苷酸，覆盖待检测位点或待检测区域。在具体应用中，针对待检测位点或待检测区域的个数，可以使用一对或多对这样的双链寡核苷酸探针。使用双链DNA探针进行杂交预富集的原理，如图2所示，样本中含有大量外源物种DNA和其它非目标区域DNA，以及痕量的目标区域DNA(即含有待检测位点或待检测区域的DNA)。使用探针包含目标区域DNA的接头连接产物进行探针预富集，即可提高目标区域DNA在样本中的相对含量。由于探针仍可能有非特异性结合，故会产生非特异性预富集产物。这就需要下一步使用特异性引物进行特异性扩增。对探针预富集产物进行特异性PCR富集及终文库构建，如图3所示，使用针对待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增，即得到终文库。对终文库进行测序，即可检测待检测位点或待检测区域的突变情况，本专利技术中，待检测位点或待检测区域突变情况包括点突变、插入、缺失和基因融合中的至少一种。探针预富集的非特异性产物由于只有通用引物与之结合，而并无特异性引物与之结合，所以无法进行PCR富集。如图3所示，上游特异性引物和下游特异性引物可以分别是多条引物组成的引物组，即上游特异性引物组和下游特异性引物组，也就是多个待检测位点或待检测区域特异性引物的混合物。引物组中的每条引物可以分别针对特定的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中所述探针是双链寡核苷酸，所述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对所述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。

【技术特征摘要】
1.一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中所述探针是双链寡核苷酸，所述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对所述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。2.根据权利要求1所述的从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。3.根据权利要求1所述的从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述探针带有亲和标记；优选地，所述亲和标记是位于所述探针两条链的5’端的生物素标记。4.根据权利要求1所述的从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述步骤(b)使用多条所述上游特异性引物组成的引物组和多条所述下游特异性引物组成的引物组。5.根据权利要求1所述的从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，其特征在于，所述探针长度为150-200bp。6.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，宋卓，袁梦兮，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43