一种肺炎克雷伯菌特异基因的应用制造技术

发明专利技术公开了一种肺炎克雷伯菌的特异基因的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；根据该基因设计检测肺炎克雷伯菌引物，应用于环介导等温扩增和聚合酶链式反应体系，其具有特异性良好、灵敏度较好、检测快速可靠、操作简单的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎克雷伯菌特异基因的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种肺炎克雷伯氏菌的特异基因的新用途，具体是将其应用于建立肺炎克雷伯菌检测技术方法中。
技术介绍
肺炎克雷伯菌（KlebsiellaPneumoniae）为革兰阴性杆菌，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。肺炎克雷伯菌是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，随着β-内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC酶）以及氨基糖苷类修饰酶（AMEs），对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。因此，快速准确地检测出肺炎克雷伯菌就显得尤为重要。目前临床应用的肺炎克雷伯菌的检测方法包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，操作繁琐，费时耗力；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序列，在此基础上建立了众多的检测技术。其中主要有核酸探针检测技术、实时荧光PCR检测技术、LAMP和PCR技术，这些方法因其特异性强、灵敏度高、省时等特点已越来越多的被应用于微生物鉴定中。本专利技术利用生物信息学寻找出肺炎克雷伯菌特异基因，并针对其设计特异引物，分别建立了PCR和LAMP两种肺炎克雷伯菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出肺炎克雷伯菌的目的。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术目的是提供一种肺炎克雷伯菌的特异基因的新用途，即其在检测肺炎克雷伯菌中的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；本专利技术通过生物信息学手段获取用于鉴定肺炎克雷伯菌的基因，该基因为hypotheticalprotein，基因名KPHS_07150，Genbank登陆号为NC_016845.1（754461..754838），该基因为肺炎克雷伯菌特有，与其他物质无明显相似性，具有种间特异，种内共有的特性。本专利技术另一目的是提供检测肺炎克雷伯菌引物，其包括引物B3、引物F3，各引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示。本专利技术另一目的是提供检测肺炎克雷伯菌引物，其包括外游引物B3、外游引物F3、内游引物BIP、内游引物FIP，各引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为：1、上述肺炎克雷伯菌特异基因，经由基于基因组的本地BLAST及筛选，并进行在线BLAST分析重确认而获得，为hypotheticalprotein，基因名KPHS_07150，Genbank登陆号为NC_016845.1（754461..754838）区段；2、PCR技术的检测方法本专利技术针对特异基因设计特异引物，所设计的引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，进行PCR反应的特异性检测，并构建了特异基因的阳性质粒，分别做了阳性质粒和基因组的灵敏度实验。实现了特异并高灵敏度检测肺炎克雷伯氏菌的目的。3、LAMP技术的检测方法本专利技术针对特异基因设计两对特异引物，包括一对外游引物和一对内游引物，即外游引物B3、外游引物F3、内游引物BIP、内游引物FIP，使用isothermalmastermix试剂分别做了基因组的特异性和灵敏度实验，特异并高灵敏度地扩增出靶序列。本专利技术的有益效果为：针对肺炎克雷伯菌的特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测肺炎克雷伯菌。附图说明图1为本专利技术PCR鉴定体系的特异性检测结果，泳道1至泳道6的反应模板为部分肺炎克雷伯菌的基因，泳道7至泳道10依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、藤黄微球菌；图2为本专利技术LAMP鉴定体系的特异性检测结果，管1到管4的反应模板为部分肺炎克雷伯菌的基因，管5到管8依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌；图3为本专利技术PCR鉴定体系的灵敏度检测结果，其中图a为阳性质粒的灵敏度结果，图b为菌液的灵敏度结果；图4为本专利技术LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果，其中管1为阳性质粒作为模板的阳性对照，管2到管7的反应模板是直接裂解梯度稀释后菌液，其浓度依次为105、104、103、102、101、100，管8为去核酸酶税作为模板的阴性对照。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术技术方案做进一步详细描述，但本专利技术保护范围不局限于所述内容。实施例1：特异性靶基因筛选及引物设计1、本地BLAST分析从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载的肺炎克雷伯菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到菌种各序列片段与数据库比对结果。2、特异性靶基因筛选使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性。一种策略为BLAST时排除目的菌种，结果显示无任何相似序列者为目的菌种特异基因；第二种策略为BLAST时选择在目的菌种内进行检索，结果返回大量相似序列者是目的菌种的不同菌株共有序列。结合两种策略，最终找出符合两种策略标准的目的基因。3、引物设计本试验以hypotheticalprotein，基因名KPHS_07150，Genbank登陆号为NC_016845.1（754461..754838）设计特异引物。特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具PrimerExplorerV5software(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计完成，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于LAMP技术检测，其中外游引物还用作PCR反应的上、下游引物，用于肺炎克雷伯菌的鉴定。实施例2：检测方法的建立1、DNA的提取（1）用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：1）取细菌培养液5mL，12，000rpm离心1分钟，尽量吸净上清；2）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟；每隔10分钟颠倒混匀数次；12，000rpm离心2分钟，尽量吸净上清；3）向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；4）向管中加入6μLRNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟；5）向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀；6）加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀；7）加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟。12，000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀；8）加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎克雷伯菌的特异基因在检测肺炎克雷伯菌中的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

【技术特征摘要】
1.一种肺炎克雷伯菌的特异基因在检测肺炎克雷伯菌中的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。2.用于权利要求1所述的应用的检测肺炎克雷伯菌引物，其特征在于：包括上游引物B3、下游引物F3，各引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉竹，杨光英，张阿梅，韩芹芹，张金阳，陈强，夏雪山，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53