本发明专利技术涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明专利技术基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测LHON mtDNA最常见的四个致病突变，解决了现有检测LHON线粒体DNA突变方法的灵敏度低和特异性不够强、容易污染和费用昂贵等问题，为LHON提供了一种精准的基因诊断方法，对该病的遗传咨询和基因治疗有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法
：本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
：Leber遗传性视神经病变(Leber’shereditaryopticneuropathy,LHON)是最常见的线粒体遗传病之一，也是青壮年视力丧失的最常见原因之一[ManPYWetal.JMedGenet,2002]。95％以上的患者是由线粒体DNA(mtDNA)的3个原发致病突变引起，包括位于MT-ND4基因的m.11778G>A，MT-ND6基因的m.14484T>C以及MT-ND1基因的m.3460G>A[CerelliVetal.ProgRetinEyeRes,2004]。而位于MT-ND1基因的m.3635G>A突变是中国人群中第4个常见突变，其突变频率与m.3460G>A突变相当[JiaXYetal.JHumGenet,2006]。通过对这4个位点进行突变检测，对于这种严重影响青壮年视力疾病的早期诊断、干预、和治疗具有重要意义。目前，一方面，市场上没有商品化的LHON常见mtDNA4位点突变检测试剂盒；另一方面，LHON的基因诊断最常见的方法有等位基因特异性PCR(AS-PCR)[CN1288254C,CN102146443A，CN101781683A]、限制性片段长度多态性(RFLP)[CN1143117A，CN102747152A，CN104774927A，CN103173545A，CN104774926A，CN103173544A]以及等位基因特异性荧光探针技术PCR[CN1721839A,CN1712543A]，检测单个或者3个常见突变位点，这些检测方法都具有简便、快速、费用低的优点，但是由于mtDNA变异在人群中发生频率高，位于原发突变邻近区域的变异会影响结果，造成假阳性或假阴性，此外，还有芯片检测法[CN101497925A,CN104805210A]，可以同时检测更多LHON相关mtDNA变异，具有准确高通量的优点，但是该方法费用昂贵。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种具有高度的敏感性、稳定性和准确性的Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。本专利技术的第一个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MT-ND4-F：5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’(如SEQIDNO.1所示)，MT-ND4-R：5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’(如SEQIDNO.2所示)；MT-ND6-F：5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’(如SEQIDNO.3所示)，MT-ND6-R：5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’(如SEQIDNO.4所示)；MT-ND1-F：5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’(如SEQIDNO.5所示)，MT-ND1-R：5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’(如SEQIDNO.6所示)。本专利技术的第二个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括上述的检测引物。优选，所述的检测试剂盒还包括2*MasterMix、ddH2O、阳性质控品和阴性质控品。所述的阳性质控品为含有SEQIDNO.8序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.10序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.12序列的质粒DNA和含有SEQIDNO.13序列的质粒DNA。所述的阴性质控品为不含有SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12和SEQIDNO.13序列的DNA序列。本专利技术的第三个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)用检测引物MT-ND4-F/MT-ND4-R、MT-ND6-F/MT-ND6-R和MT-ND1-F/MT-ND1-R分别对步骤(1)提取的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；(3)对PCR扩增产物进行测序，然后与野生型线粒体DNA相应的基因序列进行比对，确定是否存在基因突变位点。所述的测序的方法优选为Sanger测序法。Sanger测序原理，DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在反应体系中分别按照一定的比例引入四种荧光染色剂标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后，在毛细管中进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基，在毛细管电泳中的迁移率就不同，激光检测器可对荧光分子逐个进行检测，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。所述的PCR扩增的反应体系为：包含基因组DNA20ng、2*MasterMix10μL、10μM上游引物0.3μL和10μM下游引物0.3μL，其余由双蒸水补足至20μL；PCR扩增的反应程序为：94℃，预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃延伸5min。本专利技术基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测LHONmtDNA最常见的四个致病突变，解决了现有检测LHON线粒体DNA突变方法的灵敏度低和特异性不够强、容易污染和费用昂贵等问题，为LHON提供了一种精准的基因诊断方法，对该病的遗传咨询和基因治疗有重要意义。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：检测引物的设计和标准品的制备1、检测引物的设计根据NCBI数据库中mtDNA中的MT-ND4基因(GeneBank序列号为GeneID:4538；NC_012920.1；YP_003024035.1)、MT-ND6基因(GeneBank序列号为GeneID:4541；NC_012920.1；YP_003024037.1)和MT-ND1基因(GeneBank序列号为GeneID:4535；NC_012920.1；P_003024026.1)的核苷酸序列，分别在G11778A突变位点、T14484C突变位点、G3460A和G3635A两个突变位点的上下游设计检测引物。所设计的检测引物如表1所示。表1检测引物序列2、标准品的制备将SEQIDNO.7和SEQIDNO.8作为目的片段分别插入到pGH载体的多克隆位点制备得到野生型质粒pGH-G11778G和突变型质粒pGH-G11778A，将SEQIDNO.9和SEQIDNO.10作为目的片段分别插入到pGH载体的多克隆位点制备得到野生型质粒pGH-T14484T和突变型质粒pGH-T14484C，将SEQIDNO.11、SEQIDNO.12和S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MT‑ND4‑F：5’‑GCCTACCCCTTCCTTGTACT‑3’，MT‑ND4‑R：5’‑TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT‑3’；MT‑ND6‑F：5’‑GTTTACCACAACCACCACCC‑3’，MT‑ND6‑R：5’‑AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG‑3’；MT‑ND1‑F：5’‑GGCCAACCTCCTACTCCTC‑3’，MT‑ND1‑R：5’‑TGATGGCTAGGGTGACTTCA‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MT-ND4-F：5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’，MT-ND4-R：5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’；MT-ND6-F：5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’，MT-ND6-R：5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’；MT-ND1-F：5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’，MT-ND1-R：5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’。2.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括2*MasterMix、ddH2O、阳性质控品和阴性质控品。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品包括含有SEQIDNO.8序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.10序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.12序列的质粒DNA和含有SEQIDNO.13序列的质粒DNA。5.根据权利要求3所述的检...
【专利技术属性】
技术研发人员：张清炯，贾小云，黎仕强，郭向明，肖学珊，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东,44
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