一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术提供一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法，属于植物品种鉴别与育种技术领域。本发明专利技术提供21对蚕豆基因组SSR引物组成的标记组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑42所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳检测技术对蚕豆品种进行鉴定，可在短时间内完成蚕豆种子品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高效，快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明专利技术的方法可以对蚕豆种子真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为蚕豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法
本专利技术涉及分子生物学和植物品种鉴别
，特别是涉及一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法以及利用构建得到的不同品种蚕豆的指纹图谱鉴别蚕豆品种的方法及应用。
技术介绍
蚕豆(ViciafabaL.)作为一种粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物,在我国农作物中占有重要地位。蚕豆在世界各洲均有生产和分布，全世界有超过43个国家生产蚕豆。蚕豆在我国已有2000余年的栽培历史，全国除山东、海南和东北三省极少种植外，其余各地均有种植。近10年，中国蚕豆的种植面积达140多万hm2，占世界总种植面积50％左右，是世界第一蚕豆生产大国。蚕豆可通过与根瘤菌共生结瘤，固定大气中的氮素，在改善土壤营养结构中起着重要的作用。蚕豆营养丰富，蛋白质平均含量为27.6％，维生素含量均超过大米和小麦。因此开展蚕豆品种的有效甄别显得尤为重要。目前我国对蚕豆品种进行鉴定主要方法是按照NY/T2345-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南蚕豆》进行田间测定来鉴定的。该方法简便、经济，但由于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响，不能精确、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据，同时也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题。随着育种亲本的利用集中化，传统的形态学和细胞学鉴定方法测试性状多、工作量大，很难做到准确而真实的鉴定蚕豆的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。随着生物技术的发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在蚕豆品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究我国蚕豆种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建作物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simplesequencerepeat,SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它类型分子标记相比，SSR标记具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国蚕豆的品种知识产权，有必要在我国开展蚕豆开发微卫星标记开发，并应用于蚕豆优良品种“分子身份证”构建的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蚕豆SSR指纹图谱的构建方法，本专利技术的另一目的在于提供一种高效、准确、低成本的利用基因组SSR指纹图谱鉴别蚕豆品种的方法。本专利技术的目的还在于提供该方法的应用。为实现上述目的，本专利技术以48份代表性蚕豆品种基因组DNA为模板，通过分析蚕豆基因组序列和EST序列，合成核心基因组SSR和EST-SSR引物。经过筛选，分别有15对基因组SSR和6对EST-SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别48份蚕豆品种的差异。所述的48份代表性蚕豆品种见表1。表148份蚕豆品种经过多次筛选，选择在连锁群上的均匀分布、多态性较高、PCR扩增较稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测和毛细管荧光电泳检测两种技术平台，最终筛选出在蚕豆品种间多态性信息含量值最高、等位位点数最多、重复性好、扩增带型清晰度高、染色体分布均匀的SSR引物作为蚕豆品种指纹图谱库构建的核心引物。基于上述筛选方法，本专利技术提供用于鉴别蚕豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有15个SSR分子标记和6个EST-SSR分子标记，分别为SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30、SEQIDNO.31-32、SEQIDNO.33-34、SEQIDNO.35-36、SEQIDNO.37-38、SEQIDNO.39-40、SEQIDNO.41-42所示的引物。本专利技术提供一种引物组合，含有以下21对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-42所示。本专利技术提供含有上述引物组合的试剂盒。本专利技术提供了上述分子标记组合或引物组合在鉴定蚕豆品种中的应用。本专利技术提供了上述分子标记组合或引物组合在蚕豆种质资源改良中的应用。本专利技术提供了上述分子标记组合或引物组合在构建蚕豆SSR植物图谱中的应用。本专利技术还提供一种蚕豆品种SSR指纹图谱的构建方法，以本专利技术所述的含有上述21对引物的引物组合对不同蚕豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后为大片段；通过对不同位点的数据整合，形成不同蚕豆品种的SSR指纹图谱。其中，PCR扩增方法为：反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸5min，10℃保温5min；10μL扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。其中，当采用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测时，是采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电压300V，电流280mA，功率260W。当采用荧光毛细管电泳检测时，为引物加入荧光标记，详细情况见表2。本专利技术提供了利用上述构建方法构建得到的蚕豆品种指纹图谱。本专利技术构建得到的蚕豆品种指纹图谱，其如表5-表16所示。本专利技术进而提供一种鉴定蚕豆品种的方法，包括如下步骤：(1)提取待检蚕豆品种的DNA，以权利要求2所述的引物组合中的21对引物对分别对检蚕豆品种的DNA进行PCR扩增；(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别蚕豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有15个SSR分子标记和6个EST‑SSR分子标记，分别为SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16、SEQ ID NO.17‑18、SEQ ID NO.19‑20、SEQ ID NO.21‑22、SEQ ID NO.23‑24、SEQ ID NO.25‑26、SEQ ID NO.27‑28、SEQ ID NO.29‑30、SEQ ID NO.31‑32、SEQ ID NO.33‑34、SEQ ID NO.35‑36、SEQ ID NO.37‑38、SEQ ID NO.39‑40、SEQ ID NO.41‑42所示的引物。...

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别蚕豆品种的分子标记组合，其特征在于，含有15个SSR分子标记和6个EST-SSR分子标记，分别为SSR11908、EST181、SSR11771、SSR12080、SSR13683、SSR12396、SSR14328、EST1672、EST1280、EST1741、SSR17991、SSR10911、SSR13106、SSR760、EST1142、SSR11052、SSR13771、SSR11885、SSR12536、SSR12868、EST1584；所述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30、SEQIDNO.31-32、SEQIDNO.33-34、SEQIDNO.35-36、SEQIDNO.37-38、SEQIDNO.39-40、SEQIDNO.41-42所示的引物。2.一种引物组合，其特征在于，含有以下21对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-42所示。3.含有权利要求1所述分子标记组合或权利要求2所述引物组合的试剂盒。4.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的引物组合在鉴定蚕豆品种中的应用。5.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的引物组合在蚕豆种质资源改良中的应用。6.一种蚕豆品种SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，以权利要求2所述的引物组合对不同蚕豆品种的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测或对PCR产物进行荧光毛细管电泳检测，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0；上述“/”前为小片段，“/”后...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗绪晓，张红岩，杨涛，刘荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11