本发明专利技术公开了一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明专利技术所设计的引物检测特异性好,灵敏度高,非常适用于检测食品中的肠炎沙门氏菌。
【技术实现步骤摘要】
一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法
本专利技术涉及一种细菌检测方法，具体是一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法。
技术介绍
沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属，据其抗原结构和生化试验，目前已有2000余种血清型，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌较为多见。该菌为革兰氏阴性杆菌，需氧，不产生芽胞，无荚膜，绝大多数有鞭毛，能运动。对外界的抵抗力较强，在水和土壤中能活数月，粪便中能活1～2个月，在冰冻土壤中能越冬。不耐热，55℃、1h或60℃、10～20分钟死亡，5%石炭酸或1：500升汞5分钟内即可将其杀灭。多种家畜（猪、牛、马、羊）、家禽（鸡、鸭、鹅）、鱼类、飞鸟、鼠类及野生动物的肠腔及内脏中能查到此类细菌。细菌由粪便排出，污染饮水、食物、餐具以及新鲜蛋品、冰蛋、蛋粉等，人进食后造成感染。致病食物以肉、血、内脏及蛋类为主，值得注意的是该类细菌在食品中繁殖后，并不影响食物的色、香、味。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。由沙门氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康问题。在欧洲ISO6579:2002和FSISMLG4.04中；检测沙门氏菌是评估产品是否合格的必检项目。在美国，通常是肉，禽，蛋产品中检测出沙门氏菌。由沙门氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康问题。沙门氏菌是最常见的，新鲜家禽和猪的肉阳性标本的比例，根据欧洲标准（欧盟委员会法规2073/2005）用于评价产品是否符合标准，经分别检测平均为5.5％和1.1％。此外，美国食品安全检验局采用FSIS的方法，检测沙门氏菌。这两个标准的用于检测沙门氏菌培养方法（SCMS）需要长达5天，才能获得结果。这些方法包括预培养，在选择性琼脂上选择性分离，可疑菌落的生化鉴定和血清学确认。该方法是虽然准确，但费力，成本高，费时，且对短保质期的产品无法检测。目前，检测沙门氏菌的方法检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。因此，需要有新的方法能够在一个短的时间内检测，最好能在24小时之内，在一个给定的食物量中检测食品中的病原体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到BPW缓冲蛋白胨水中，培养温度为32-34℃，培养时间为22-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取基因组DNA和RNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板2μL，SYBERGreenI荧光染料0.5μL，10×Buffer3.0μL，DNA聚合酶7U，氯化铵溶液0.5μL，氯化铝溶液0.5μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，碳酸酐酶2U，脱氧肌苷溶液2μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenI荧光染料为90-110倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、蔗糖；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述氯化铵溶液的浓度为5-10mmol/L；所述氯化铝溶液的浓度为100-200mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述脱氧肌酐溶液的浓度为30-40mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90-94℃变性0.5-1.0min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30个循环，最后72℃延伸5min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为33℃，培养时间为23h。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBERGreenI荧光染料为100倍稀释。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述氯化铵溶液的浓度为8mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述氯化铝溶液的浓度为150mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述脱氧肌酐溶液的浓度为35mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（3）中92℃变性0.8min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的检测方法能准确灵敏地检测食品中的沙门氏菌，DNA最低检测浓度为5ng，而且与其他细菌无交叉反应，特异性好，同时样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本低于传统的检测方法，而且本专利技术试剂保存时间长，无污染。本专利技术对解决大批量样品的沙门氏菌的现场检测技术具有重要的现实意义。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到BPW缓冲蛋白胨水中，培养温度为32℃，培养时间为22h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取基因组DNA和RNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板2μL，SYBERGreenI荧光染料0.5μL，10×Buffer3.0μL，DNA聚合酶7U，氯化铵溶液0.5μL，氯化铝溶液0.5μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，碳酸酐酶2U，脱氧肌苷溶液2μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；所述SYBERGreenI荧光染料为90倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、蔗糖；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述氯化铵溶液的浓度为5mmol/L；所述氯化铝溶液的浓度为100mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；所述脱氧肌酐溶液的浓度为30mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90℃变性0.5min；60℃退火30s；70℃延伸1.0min；30个循环，最后72℃延伸5min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。实施例2一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到BPW缓冲蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到BPW缓冲蛋白胨水中，培养温度为32‑34℃，培养时间为22‑24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取基因组DNA和RNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板 2μL，SYBER Green I荧光染料 0.5μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 7U，氯化铵溶液 0.5μL，氯化铝溶液0.5μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，碳酸酐酶 2U，脱氧肌苷溶液 2μL，其余用dd H
【技术特征摘要】
1.一种食品中肠炎沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以肠炎沙门氏菌clpP基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到BPW缓冲蛋白胨水中，培养温度为32-34℃，培养时间为22-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取基因组DNA和RNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板2μL，SYBERGreenI荧光染料0.5μL，10×Buffer3.0μL，DNA聚合酶7U，氯化铵溶液0.5μL，氯化铝溶液0.5μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，碳酸酐酶2U，脱氧肌苷溶液2μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenI荧光染料为90-110倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、蔗糖；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述氯化铵溶液的浓度为5-10mmol/L；所述氯化铝溶液的浓度为100-200mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述脱氧肌酐溶液的浓度为30-40mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，9...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敏芳，徐静，赵春城，胡勇，蒋韦艳，刘金杰，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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