一种利用微生物发酵生产ARA的方法技术

本发明专利技术属于发酵工程领域，涉及一种利用微生物发酵生产ARA的方法，具体地，涉及利用高山被孢霉菌株工业化发酵生产含花生四烯酸(ARA)混合油脂的方法。更具体地，本发明专利技术涉及一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：从发酵罐培养的100－140小时开始，将发酵温度控制在20－25℃；和/或，从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上。本发明专利技术的方法制备ARA，产量高，纯度高，并且有利于ARA的大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物发酵生产ARA的方法
本专利技术属于发酵工程领域，涉及一种利用微生物发酵生产ARA的方法，具体地，涉及利用高山被孢霉菌株工业化发酵生产含花生四烯酸(ARA)混合油脂的方法。
技术介绍
ARA，又称花生四烯酸，全名二十碳四烯酸(cis－5,8,11,14－arachidonicacid,ARA)，是ω－6系列的一种多元不饱和脂肪酸。ARA是一种人体重要的必需脂肪酸，也是人体中含量最高、分布最广的一种多不饱和脂肪酸。ARA在血液、肝脏、肌肉和其他器官系统中作为磷脂结合的结构脂类起重要作用，ARA是许多循环二十烷酸衍生物的直接前体。这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。此外，有研究表明，ARA降血脂、降血压和降血胆固醇的效果均强于亚油酸和亚麻酸；同时能缓解氯化钡、乌头碱等引起的心律不齐，其作用效果也强于亚油酸和亚麻酸。因此，ARA具有重要的营养、保健和医疗功能。目前，ARA主要由微生物发酵法生产。公开号为CN105112466A的专利公开了一种添加产物促进剂发酵制备花生四烯酸的方法，其所公开的添加产物促进剂的摇瓶在培养结束后检测发酵液中ARA含量为5.41g/L，产量较对照提高了45.1％。公开号为CN102925502A的专利公开了一种利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法，其所公开的产量为花生四烯酸的单位产量达到10g/L发酵液。公开号为CN104278107A的专利公开了一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其所公开的产量为25m3发酵罐发酵高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸占总油脂的百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到55g/L、54％、65％、20.628g/L，花生四烯酸生产强度达到1.753g/(L·d)，这也是目前报道的采用高山被孢霉大规模工业化生产ARA的最高生产水平。虽然其ARA生产率较之前的研究有了较大提高，但对于利用高山被孢霉进行工业化生产花生四烯酸，大大降低其生产成本，提高单位产量，使微生物发酵工业化生产ARA的方法能够得到大力推广和普及使用还是远远不够的。现有从高山被孢霉发酵培养物中提取ARA的方法主要有三种，一是离心法，二是有机溶剂萃取法，三是超临界萃取法。离心法如公告号为CN1282745C的专利公开了一种从微生物细胞中获得油的方法，所述的油包含一种或多种不饱和脂肪酸，该方法包括：(a)裂解微生物细胞的细胞壁以释放出油来；和(b)通过离心从至少部分(a)中所形成的细胞壁碎片中分离油。但该专利技术离心后的油层品质较差，除含油脂外，还含有水分、培养基成分和细胞碎片，不利于后续的精炼，另外离心后的废水层含有大量菌渣，COD很高，难以处理或处理成本极高。有机溶剂萃取法如公告号为CN101109015B的专利公开了一种花生四烯酸油脂的制备方法，其中所述的油脂提取方法为：将老化后的菌体收集、烘干、磨碎，用石油醚和乙醇萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到花生四烯酸油脂。但该方法使用到有机溶剂进行萃取，最终产品可能会有溶剂残留，且萃取过程存在易燃易爆等安全隐患。超临界萃取方法如公开号为CN101579019A的专利公开了一种用CO2超临界萃取法提取多不饱和脂肪酸油脂的方法，其步骤如下：①粉碎过筛；②加温萃取；③将液态CO2注入萃取釜中，加压；④萃取完毕收集油脂。但超临界设备价格昂贵，萃取收率也不高，该专利技术萃取出油率最高只有50％。现有技术中ARA毛油的精炼多采用化学精炼技术，ARA毛油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到ARA精油。该工艺技术不可避免地存在一些问题，如：碱炼为了达到控制酸价低的要求，通常都会加入过量碱，部分甘油三酯不可避免会被皂化；碱炼产生的高COD废水会污染环境；碱炼需要高温处理时间长，容易造成产品过氧化值、茴香胺值升高；脱臭温度高、时间长易产生反式脂肪酸等缺点。目前，尚需要开发新的ARA生产工艺。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种培养用于生产ARA的微生物的方法。本专利技术人惊奇地发现，所述培养方法能够大幅度地提高生物量及ARA产量。进一步地，本专利技术人还发现了一种提取ARA毛油的方法，所述提取方法能够提高ARA毛油的提取收率和品质。进一步地，本专利技术人还发现了一种纯化ARA毛油的方法，其能够提升ARA成品油的各项技术指标和纯化收率。本专利技术显著地提高了含ARA的粗油脂产量、ARA产量以及ARA生产率。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：从发酵罐培养的100－140小时开始，将发酵温度保持在20－25℃(例如21－25℃、20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)；优选地，直至发酵结束；和/或从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)；优选地，直至发酵结束。在本专利技术的一个实施方案中，所述的培养方法，其中：从发酵罐培养的105－135小时、110－130小时、115－125小时(例如115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125小时)或者120小时开始，将发酵温度控制在20－25℃(例如21－25℃、20－24℃、21－23℃、22－25℃、22－24℃、23－25℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃)，和/或从发酵罐培养的第8天、第9天或者第10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上(例如55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)。在本专利技术的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在保持发酵温度为20－25℃之前，发酵温度为25－30℃(例如26－30℃、25－29℃、26－28℃、27－30℃、26－29℃、28－30℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)。在本专利技术的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵液的pH为6.0－7.0；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，发酵液中葡萄糖的浓度保持1－5g/L(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5g/L)。在本专利技术的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵液中葡萄糖的浓度1－2g/L；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵温度20－25℃；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，停止搅拌；优选地，将上述3个条件即葡萄糖浓度、发酵温度、停止搅拌，保持至发酵结束；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，滤去发酵液，并加入适量水或新鲜的发酵培养基。在本专利技术的一个实施方案中，所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养还包括在发酵罐培养起始的36－60小时(例如40－56小时、42－54小时、44－52小时、46－50小时、46、47、48、49或50小时)，进行分罐培养的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：从发酵罐培养的100－140小时开始，发酵温度为20－25℃；优选地，直至发酵结束；和/或从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上；优选地，直至发酵结束。

【技术特征摘要】
1.一种培养用于生产ARA的微生物的方法，其中：从发酵罐培养的100－140小时开始，发酵温度为20－25℃；优选地，直至发酵结束；和/或从发酵罐培养的第8－10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上；优选地，直至发酵结束。2.根据权利要求1所述的培养方法，其中：从发酵罐培养的105－135小时、110－130小时、115－125小时或者120小时开始，发酵温度为20－25℃，和/或从发酵罐培养的第8天、第9天或者第10天开始，停止通气或者将通气量减少50％以上。3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其中，在发酵温度为20－25℃之前，发酵温度为25－30℃。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的培养方法，其中，所述发酵液的pH为6.0－7.0；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，发酵液中葡萄糖的浓度为1－5g/L。5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的培养方法，其中，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵液中葡萄糖的浓度为1－2g/L；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，发酵温度为20－25℃；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上的同时或之后，停止搅拌；优选地，在停止通气或者将通气量减少50％以上之前，滤去发酵液，并加入适量水或新鲜的发酵培养基。6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养还包括在发酵罐培养起始的36－60小时(例如48小时)，进行分罐培养的步骤；例如，分为两个或更多个发酵罐进行发酵罐培养。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的培养方法，其在发酵罐培养之前，还包括接种和种子扩大培养的步骤；优选地，所述种子扩大培养包括一级种子扩大培养和二级种子扩大培养；优选地，所述一级种子扩大培养包括下述步骤：按照0.4％－1％的接种量将摇瓶种子液接入装有灭菌后培养基的一级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养30－35h，完成一级种子扩大培养；优选地，所述二级种子扩大培养包括下述步骤：按照1％－3％的接种量将一级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的二级种子罐中，培养温度25－32℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，培养20－25h，完成二级种子扩大培养。8.根据权利要求7所述的培养方法，还包括在接种和种子扩大培养之前，进行活化培养的步骤；优选地，所述活化培养的温度为25－32℃，搅拌转速100－200rpm，时间为40－48h。9.根据权利要求7或8所述的培养方法，其中，所述发酵罐培养包括下述步骤：按照1％－3％的接种量将二级种子罐的种子液接入装有灭菌后培养基的发酵罐中，培养温度20－30℃，通气量1－2vvm，罐压0.02－0.05MPa，搅拌转速0－50rpm，进行发酵罐培养。10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的培养方法，其中用于生产ARA的微生物为高山被孢霉或其突变菌株；优选地，所述高山被孢霉选自保藏号为CCTCCNo.M2012073、CCTCCNo.M2013392、CCTCCNo.M2015421和ATCCNo....

【专利技术属性】
技术研发人员：文昌，陈必钦，王炳荣，王跃飞，蒋四富，徐鲁明，吴轶，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司，厦门金达威集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15