一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用技术

技术编号:15515274 阅读:200 留言:0更新日期:2017-06-04 06:46
本发明专利技术涉及一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用,该载体以季戊四醇为核心,具有四条臂,为星型结构,每条臂的分子量相等。本发明专利技术首次公开了基于星型聚阳离子衍生物(s‑PGEA‑FA)的纳米基因载体,其侧基含有FA配体和/或丰富的亲水性的羟基与仲胺基团,该载体通过原子转移自由基聚合、开环反应、酰胺化反应而合成出来,在不同的食管癌细胞系中介导miR‑101、miR‑217的高效递送,可高效沉默lncRNA MALAT1表达并进而杀伤食管癌细胞并抑制其侵袭转移;在食管癌的治疗方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用,特别涉及一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法及其应用于介导miRNA在食管癌细胞中高效递送方面的药物,属于药物载体

技术介绍
作为死亡率极高的一种恶性肿瘤中,食管癌在包括中国在内的亚洲国家发病率逐年上升。大量流行病学证据表明,包括过度饮酒、过度吸烟、微量营养素缺乏、日常饮食中摄入致癌物等众多环境危险因素都可以导致食管癌的发生。然而,只有部分暴露于这些危险因素中的个体最终罹患食管癌,提示人类个人遗传因素也可影响食管癌的发生。近年来的研究表明,非编码RNAs(ncRNAs)可能在癌症的发生发展以及正常细胞的恶性转化中发挥着重要的作用。如:一类长度为约22个核苷酸(nt)的ncRNA,microRNA(miRNA),在调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移中发挥着重要的作用。食管癌中,miR-101和miR-217作为肿瘤抑制基因通过靶向性基因沉默长链非编码RNA(lncRNA)MALAT1的表达,从而抑制食管癌细胞的增殖和侵袭转移。由于miRNA在癌症中扮演的重要角色,越来越多的科学家们把注意力集中于它们在癌症治疗的有效递送方法研究上。然而,在miRNA的高效递送过程中存在众多问题需要解决。例如,miRNA在细胞内的不稳定性和在靶向组织中的摄入量不足。叶酸(FA)是包括肿瘤细胞在内众多细胞维持生长的必须物质。叶酸受体(FR)在许多恶性肿瘤,如食管癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌和脑瘤中高表达。此外,叶酸的γ-羧基通过化学衍生化作用后可以保留叶酸的高效靶向性。乙醇胺官能化(聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGEA)为基础的载体表现出很好的传递DNA或RNA的特点,可能是因为PGEAs的化学结构包含丰富的羟基和仲胺基团,而且,其星状结构有利于转染功能的发挥。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足,提供一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用。本专利技术技术方案如下:一种富含羟基的纳米基因载体,该载体以季戊四醇为核心,具有四条臂,为星型结构,每条臂的分子量相等,化学结构如下所示:式中:n值为33~48,m值为2~5。根据本专利技术优选的,所述载体的数均分子量为3.3×104~5.2×104g/mol。上述载体中的臂含有丰富的羟基和仲胺以及少量的叶酸残基。在食管癌细胞中介导MALAT1沉默的富含羟基的纳米基因载体的制备方法,包括如下步骤:(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中,季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(6~8),在45~55℃反应22~26小时,制得PER-Br;(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和步骤(1)中制得的PER-Br加入二甲基亚砜(DMSO)中,GMA的浓度为3.8~6.3mmol/mL,然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA),PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:(300~400):1:2,在室温下经原子转移自由基聚合反应2.5~3.5小时,制得星型的s-PGMA,然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中,s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:(3000~4000),75~85℃反应30~50分钟,制得s-PGEA;(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中,s-PGMA的浓度为0.17~0.25mg/mL,然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED),s-PGMA、EA与ED的摩尔比为1:(2700~3600):(300~400),在75~85℃搅拌反应30~50分钟,经纯化,制得s-PGEAED溶液;(4)配制含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)的DMSO溶液,制得混合液,N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为19.76~59.28μmol/mL,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为19.76~59.28μmol/mL,按摩尔浓度16.5~49.4μmol/mL的比例向混合液中加入二水合叶酸(FA),室温搅拌22~26小时,制得叶酸体系;然后,向叶酸体系中加入质量浓度为8.3~12.5mg/mL的步骤(3)制得的s-PGEAED溶液,叶酸体系与s-PGEAED溶液的体积比为1:5,氮气保护下反应22~26小时,经纯化,制得终产物s-PGEA-FA。根据本专利技术优选的,所述步骤(3)中的纯化,采用截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析,然后在-60~-50℃、0~100pa条件下冻干48h以上。根据本专利技术优选的,所述步骤(4)中的纯化,采用截留分子量为3.5kDa的透析袋在去离子水中透析,然后在-60~-50℃、0~100pa条件下冻干48h以上。原理说明在本专利技术中,含叶酸配体的功能化的星形PGEA(s-PGEA-FA)是通过原子转移自由基聚合(ATRP)反应、开环反应、酰胺化反应合成的复合物。为了合成叶酸(FA)功能化的s-PGEA(s-PGEA-FA),s-PGMA与过量的EA和ED反应,生成s-PGEAED。s-PGEAED不仅包含羟基和仲胺基,还包含少量的伯胺,伯胺可以通过酰胺化与叶酸上的羧基连接以生成s-PGEA-FA(如图1所示)。有益效果1、本专利技术首次公开了基于星型聚阳离子衍生物(s-PGEA-FA)的纳米基因载体,其侧基含有FA配体和/或丰富的亲水性的羟基与仲胺基团,该载体通过原子转移自由基聚合、开环反应、酰胺化反应而合成出来,在不同的食管癌细胞系中介导miR-101、miR-217的高效递送,可高效沉默lncRNAMALAT1表达并进而杀伤食管癌细胞并抑制其侵袭转移;在食管癌的治疗方面具有广阔的应用前景;2、本专利技术制备的s-PGEA-FA与现有s-PGEA相比,在不同的食管癌细胞中,将s-PGEA-FA作为肿瘤抑癌miRNA的有效载体,络合而成的miR-101及miR-217形成的s-PGEA-FA/miRNA纳米复合物表现出良好的miRNA递送效率,可高效沉默lncRNAMALAT1表达并进而杀伤食管癌细胞并抑制其侵袭转移,在不同的食管癌细胞系如KYSE30、KYSE450和KYSE150中具有较高的miRNA递送能力;可有效地诱发细胞增殖的抑制、细胞周期的阻滞,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭;附图说明图1、不同的s-PGEA-FA/RNA纳米复合物的检测结果图;其中:A、不同的s-PGEA-FA/RNA纳米复合物的(a1)粒径和(a2)电位;B、s-PGEA/NC(阴性对照RNA)和s-PGEA-FA/NC纳米复合物在N/P比5和10的原子力显微镜图片;图2、s-PGMA、s-PGEA、s-PGEAED和s-PGEA-FA由1HNMR检测结果及化学结构图;其中:(a)s-PGMA的1HNMR检测结果及化学结构图;(b)s-PGEA的1HNMR检测结果及化学结构图;(c)s-PGEAED的1HNMR检测结果及化学结构图;(d)s-PGEA-FA的1HNMR检测结果及化学结构图;图3、s-PGEA或s-PGEA-FA相对表达结果本文档来自技高网
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一种富含羟基的纳米基因载体及其制备方法与应用

【技术保护点】
一种富含羟基的纳米基因载体,该载体以季戊四醇为核心,具有四条臂,为星型结构,每条臂的分子量相等,化学结构如下所示:

【技术特征摘要】
1.一种富含羟基的纳米基因载体,该载体以季戊四醇为核心,具有四条臂,为星型结构,每条臂的分子量相等,化学结构如下所示:式中:n值为33~48,m值为2~5。2.如权利要求1所述的纳米基因载体,其特征在于,所述载体的数均分子量为3.3×104~5.2×104g/mol。3.在食管癌细胞中介导MALAT1沉默的富含羟基的纳米基因载体的制备方法,包括如下步骤:(1)分别将季戊四醇与2-溴异丁酰溴加入二甲基甲酰胺中,季戊四醇与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(6~8),在45~55℃反应22~26小时,制得PER-Br;(2)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和步骤(1)中制得的PER-Br加入二甲基亚砜(DMSO)中,GMA的浓度为3.8~6.3mmol/mL,然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA),PER-Br、甲基丙烯酸缩水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩尔比为1:(300~400):1:2,在室温下经原子转移自由基聚合反应2.5~3.5小时,制得星型的s-PGMA,然后将s-PGMA与乙醇胺分别加入到二甲基亚砜(DMSO)中,s-PGMA与乙醇胺的摩尔比为1:(3000~4000),75~85℃反应30~50分钟,制得s-PGEA;(3)将步骤(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亚砜中,s-PGMA的浓度为0.17~0....

【专利技术属性】
技术研发人员:杨明徐福建任艳利李瑞全
申请(专利权)人:山东省肿瘤防治研究院
类型:发明
国别省市:山东,37

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