IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型及构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型及构建与应用；通过同源重组，用2.245‑kb frt‑neo‑frt‑loxp‑Flox‑loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS

【技术实现步骤摘要】
IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型及构建与应用
本专利技术涉及生物
中的动物模型，更具体地说，是涉及一种IRTKS基因肝脏特性剔除的小鼠模型，其构建方法，及其应用。
技术介绍
糖尿病是由遗传因素，环境因素和生活行为等多种因素共同作用引起的一种以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病的患病率，致残率和病死率以及对总体健康的危害程度，已居于慢性非传染性疾病的第三位，糖尿病及其并发症所造成的死亡率人数也已居于世界死亡原因的第五位。有研究报道2013年世界糖尿病患病人数已达到3.82亿，并预计到2030年增加到5.52亿人。过去30多年来，随着我国经济快速发展，国内糖尿病的患病率增加了十几倍，1980年全国14省市30万人调查资料显示糖尿病的患病率为0.67％；2010年调查显示，我国18岁以上的人群糖尿病患病率为9.7％。根据国际糖尿病联合会的数据，我国2014年的糖尿病患病人数为9629万人，位居全球首位。因此糖尿病的高发病率引起全球的高度重视。为了深入探索糖尿病的发病机制，良好的动物模型是非常必要的研究工具。早期，研究人员通过物理，化学，生物等致病因素，人工诱发具有糖尿病特征的实验动物模型，自发性遗传性糖尿病模型由于没有人为的干预因素，更能模拟人类真实的糖尿病发病机制，其应用于糖尿病发病机制及并发症方便的科研价值较大，较常见的有ob/ob，db/db小鼠等，分别是由于瘦素基因或瘦素基因受体的突变导致的肥胖伴随严重的胰岛素抵抗，但这些动物模型的局限性在于它所基于的基因突变遗传背景在人类患者中并不常见。近年来，随着研究人员对糖尿病发病机制了解的深入，以及转基因动物模型技术的日趋成熟，基于疾病的相关关键信号通路的转基因或基因剔除动物模型在糖尿病的研究中应用增多。另一方面，由于糖尿病是一组多种遗传背景和环境因素相互作用而引发的临床综合症，目前虽然开发的糖尿病动物模型很多，但与人类糖尿病仍有偏差，至今尚无与人类糖尿病完全吻合的动物模型。基于糖尿病发病机制的研究新进展，开发获得较好模拟人类糖尿病的动物模型仍然是我们探索糖尿病，胰岛素抵抗的有效工具和必需研究途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型及构建与应用。它可以为糖尿病的研究及分子发病机制的探讨提供研究模型。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型的构建方法，通过同源重组的方法，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合体小鼠；将获得的嵌合体小鼠与肝脏特异性表达Cre的小鼠Alb-Cre交配，最终获得IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型。优选的，所述构建方法包括如下具体步骤：S1、构建IRTKS-CKO质粒；S2、ES细胞基因打靶及筛选阳性克隆；S3、阳性ES克隆注射小鼠囊胚，获得IRTKSflox/+的嵌合体小鼠；S4、将嵌合体雄鼠与雌鼠繁育，获得双臂阳性F1代小鼠；S5、将F1代小鼠或其后代与Alb-Cre小鼠交配。优选的，步骤S1中，IRTKS-CKO质粒DNA用NotI酶切，分离纯化，无水乙醇沉淀，无菌PBS重悬，获得IRTKS-CKO质粒。优选的，步骤S2中，ES细胞为SCR012，克隆筛选条件为300μg/mlG418和2μMGanC筛选8天。优选的，步骤S2还包括用PCR方法鉴定阳性ES克隆；5’PCR鉴定的引物对序列如SEQIDNO：1、2所示；3’PCR鉴定的引物对序列如SEQIDNO：3、4所示。优选的，步骤S3中，所述嵌合体小鼠为嵌合率在50％以上的雄性小鼠。优选的，步骤S3中提供囊胚的小鼠和步骤S4中的雌鼠均为C57BL系小鼠。优选的，步骤S5还包括用PCR方法鉴定基因型；野生型WTPCR的鉴定引物对为SEQIDNO：7、8，突变型NeoPCR的鉴定引物对为SEQIDNO：5、6。第二方面，本专利技术还涉及一种上述构建方法获得的IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型。第三方面，本专利技术还涉及一种上述构建方法获得的IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型在制备或筛选糖尿病治疗药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术通过同源重组，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合体小鼠。利用Cre重组酶的特性，将获得的嵌合体小鼠与肝脏特异性表达Cre的小鼠Alb-Cre交配，构建了可靠的IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型。2)通过对IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型体重，空腹血糖，糖耐量，及病理检测分析，发现IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠出现体重增加，高血糖，葡萄糖耐量降低，并且肝脏切片中伴有空泡样脂肪变，这与人类的发病特征相符，从而为糖尿病发病机制的研究以及治疗药物的评价和筛选提供了良好的动物模型。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1是本专利技术实施例1IRTKS-CKO小鼠的打靶质粒构建示意图；其中，A为打靶载体的构建策略，B为打靶载体的示意图，C为IRTKS-CKO打靶示意图；图2是本专利技术实施例1IRTKS-CKO小鼠的基因型鉴定结果示意图；其中，a为首代嵌合体小鼠基因型的5’arm的鉴定结果，b为首代嵌合体小鼠基因型的3’arm的鉴定结果；图3是本专利技术实施例2IRTKS-LKO小鼠的基因型鉴定策略，其中P5/P6引物扩增的neo为插入loxp位点单个等位基因，P7/P8引物扩增的WT为未插入loxp位点的单个等位基因；图4是本专利技术实施例2IRTKS基因肝脏特异性剔除小鼠的基因型PCR鉴定结果示意图；图5是本专利技术实施例2荧光定量PCR鉴定不同组织中IRTKSmRNA的表达水平；图6是本专利技术实施例2IRTKS基因肝脏特异性剔除小鼠的基因型Western-blot验证结果示意图；图7是本专利技术实施例3中野生型和IRTKS基因肝脏特异性敲除的雄性小鼠体重对比示意图；图8是本专利技术实施例3中野生型和IRTKS基因肝脏特异性敲除的雄性小鼠空腹血糖值对比示意图；图9是本专利技术实施例3中野生型和IRTKS基因肝脏特异性敲除的雄性小鼠胰岛素耐量曲线图；图10是本专利技术实施例3中野生型和IRTKS基因肝脏特异性敲除的雄性小鼠肝脏组织HE染色图；其中，a为WT小鼠在正常饮食下肝脏的HE染色结果，b为LKO小鼠在正常饮食下肝脏的HE染色结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、IRTKS-CK本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过同源重组的方法，用2.245‑kb frt‑neo‑frt‑loxp‑Flox‑loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS

【技术特征摘要】
1.一种IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过同源重组的方法，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合体小鼠；将获得的嵌合体小鼠与肝脏特异性表达Cre的小鼠Alb-Cre交配，最终获得IRTKS基因肝脏特异性剔除的小鼠模型。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下具体步骤：S1、构建IRTKS-CKO质粒；S2、ES细胞基因打靶及筛选阳性克隆；S3、阳性ES克隆注射小鼠囊胚，获得IRTKSflox/+的嵌合体小鼠；S4、将嵌合体雄鼠与雌鼠繁育，获得双臂阳性F1代小鼠；S5、将F1代小鼠或其后代与Alb-Cre小鼠交配。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，IRTKS-CKO质粒DNA用NotI酶切，分离纯化，无水乙醇沉淀，无菌PBS重悬，获得IRTKS-CKO质粒。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩泽广，黄丽钰，吴崇超，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31