一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法技术

本发明专利技术公开一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法，包括如下步骤：(1)ELPs介导的C‑intein融合LfcinB重组质粒的构建；(2)以大肠杆菌为宿主制备Titin‑LfcinB、Telethonin‑LfcinB两种融合抗菌肽，混合后制备得到ZT‑LfcinB。本发明专利技术将表达、纯化和稳定利用相耦合在一起，使整个小肽从构建在表达载体到体外组装成带有稳定支架的药物，是一个整体流程，较好地克服了某些蛋白质及小肽表达生产和利用效率普遍较低的实际问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法
本专利技术属于生物医药与疾病免疫领域，更具体地讲，涉及一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法。
技术介绍
自1940年代发现青霉素以来，抗生素的广泛使用让人们摆脱了细菌性感染带来的恐惧。但随着抗生素的长期使用以及滥用，刺激了病原微生物耐药性的产生。耐药性结核杆菌、MRSA等对人类和动物的危害日趋严重，对社会造成了惨重的经济损失。新型抗生素的筛选进展也因为细菌的耐药性而变得愈加困难。在合成抗生素发展缓慢的情况下，如何克服因抗生素引起的细菌耐药性问题是当前研究的热点。研究发现，有的生物在受到微生物感染后，会迅速产生一些具有抗菌活性的小分子物质——抗菌肽参与机体免疫。随后科学家们又陆续从植物、微生物、两栖动物、昆虫、哺乳动物乃至人体内鉴定出上千种抗菌肽，说明它几乎是所有生命物种都具有的重要免疫分子。这类抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌细胞等生物活性，从氨基酸组成、合成机制和作用机制等方面都与传统的微生物(细菌、真菌和链霉菌等)产生的抗生素完全不同。因此，抗菌肽作为一种生物来源的、核糖体合成的小分子肽，在新型抗菌剂开发领域具有毋庸置疑的潜在优势，逐渐成为生物医药学科的研究热点[1]。人们积极探索抗菌肽的药用价值，希望开发出替代传统抗生素的新型抗菌剂，为解决病原菌对抗生素逐渐产生的耐药性问题提供新途径。1972年瑞典科学家BomanH.G.领导的研究小组，通过将大肠杆菌注射到惜古比天蚕蛹中，在诱导的天蚕免疫血淋巴中发现并提纯得到了抗菌肽P9A和P9B。通过氨基酸序列测序分析，确定了此类抗菌肽的一级结构，并将之命名为天蚕素(cecropins)，这也是人类发现并得到的第一个抗菌肽。抗菌肽(AntimicrobialPeptide，AMPs)由10～50个氨基酸构成，是生物先天性非特异性防御系统的重要组成部分。AMPs具有广谱抗菌活性、高效性、稳定性等特点，对细菌、真菌甚至是艾滋病病毒和癌细胞也具有很强的抑制作用。此外，由于它们的作用靶点主要位于微生物的细胞膜上，诱导微生物细胞膜去极化，导致细胞破裂，因此，不易引起微生物抗性突变产生，是替代传统抗生素的有力候选者之一。目前，人们主要通过三种方法获得目的抗菌肽:(1)生物提取，(2)化学合成，(3)利用基因工程手段表达，它们各有优缺点。(1)生物提取的抗菌肽生物体内诱导产生抗菌肽，其缺点是含量低、难度大、效率低、对技术和成本要求高，难以实现规模化生产，且对于一些高等生物和人源抗菌肽的生产来说也不现实。(2)化学合成的抗菌肽随着对多肽和蛋白质化学结构的进一步深入研究和多肽合成技术的诞生，人工合成活性肽的方法为抗菌肽的研究提供了很大便利。许多研究结果表明，化学合成的AMPs表现出与天然AMPs相同的生物学活性，但化学合成方法同样面临着成本高昂的问题，限制了抗菌肽的广泛应用。(3)基因工程表达的抗菌肽对大量抗菌肽分子结构的分析和比较后人们发现，计算机辅助设计新型抗菌肽并利用基因工程技术制备是新药开发的一个重要手段。抗菌肽分子量小，化学结构简单，抗菌谱广，无抗生素抗性，免疫反应性低，便于合成，这些优点有利于人们利用计算机软件对抗菌机理进行测试分析和修饰改造。基因工程技术的飞速发展使抗菌肽大规模制备成为可能，但目前也存在着许多问题。通过基因工程技术在细菌中表达抗菌肽分子量小，表达的产物可能对宿主有害，进而对基因的高水平表达造成不良影响。如何有效降低抗菌肽表达产物对宿主菌的毒性，提高表达效率，是抗菌肽利用基因工程表达亟待解决的问题。在宿主菌融合表达中，亲和层析的应用最为广泛。传统的亲和层析是将亲和标签在DNA水平上与目的蛋白序列融合。然后将细胞破碎液通过亲和柱，分离得到目的蛋白。但层析技术所使用的亲和介质昂贵，且常需通过蛋白酶水解作用将亲和标签从融合蛋白上除去。就工业应用而言，亲和标签的去除是蛋白生产过程中花费最昂贵的一步。外源物的添加还可能影响目的蛋白的生物活性。此外，抗菌肽分子量小，容易降解，进一步降低了回收率，使多肽生产的成本大幅提高。因此，亟需我们开发新型的抗菌肽表达纯化体系，为工业化制备抗菌肽奠定基础。类弹性蛋白(Elastin-likepolypeptides,ELPs)是一种从基因水平改编的人造生物聚合物，它是广泛存在于脊椎动物结缔组织中的弹性蛋白(elastins)的衍生物。类弹性蛋白由一个重复的五肽单位Val–Pro–Gly–Xaa–Gly构成，其中Xaa可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸。而将功能性目的蛋白N-端或C-端与ELP融合后的体系则被称为ELPylation。(1)类弹性蛋白(ELPs)的结构与理化性质ELPs是以Val–Pro–Gly–Xaa–Gly(VPGXG)五肽为单位而组成的聚合体，是弹性蛋白的衍生物。其中，Xaa又叫客残基“guestresidue”，它可以是除脯氨酸(Pro)外的其他氨基酸，因为脯氨酸会破坏相变。文献中也是根据第四位氨基酸的种类和出现的次数对ELPs进行分类的。为了使特定ELP的结构标注显得简洁并标准，有人提出了如下的表示形式：[XiYjZk]nX，Y，Z——每个字母表示出现在五聚体第四位的氨基酸；i，j，k——表示第四位氨基酸出现在五聚体单位中的比率；n——表示所给出的ELP五聚体的总个数。ELPs属于三类热敏生物聚合物中的一种，其性质随环境温度的的变化而改变。水溶性的ELPs具有较低临界溶解温度，即当温度高于所谓的相变温度时，ELPs在温度变化较窄范围内(2～3℃)由可溶状态变为聚沉状态，此过程称为凝聚作用。Meyer将相变温度Tt定义为：当升高溶液温度使ELP发生凝聚致溶液混浊度增加到初始值一半时的温度值为相变温度。当溶液温度低于Tt时，游离的聚合物链呈无序的水合状态(可溶形式)；当溶液温度高于Tt时，聚合物链呈现出更加有序的结构(β-螺旋)，通过疏水相互作用而变得稳定，同时分子内的β-结构也加强了聚合链之间的结合能力。然而上述过程是可逆的，当环境温度降低时ELP也会从凝聚状态转变成可溶形态。有趣的是，即使将ELP与其他蛋白融合，这种与温度相关的相变可逆性质仍然存在。G和L蛋白与ELP结构域融合，发现其在一定温度范围内仍相变可逆。ELPs的Tt值取决于几个因素。如溶液中ELP的浓度、溶液的离子强度、盐浓度和聚合物的分子质量，此外融合蛋白的性质也对Tt值有一定影响。随着这些参数值的升高，Tt降低。对于一个给定的生物聚合体而言，单体第四位上氨基酸的不同也对Tt值有影响。当这个位置的氨基酸属于疏水基团时，Tt较低；反之为亲水基团时，Tt值升高(影响取决于特殊残基的摩尔比率)。通过改变五肽单位的第四位残基，可设计得到理想的Tt值。如果第四位的氨基酸残基易受到电离作用的影响，那么可以通过改变pH值对Tt值进行调节；而当氨基酸带有能进行化学反应的侧链时，可将其他分子与ELP偶联。(2)内含肽来源与结构和功能1990年，Hirata的研究小组与Kane的小组分别在编码酿酒酵母空泡膜H+-ATP酶的VMA1基因中发现了一个框内插入片段，并出现在前体mRNA中，随Vmal蛋白一起翻译，而在翻译后被切除。因其与RNA内含子从前体mRNA上剪切下来的过程类似，所以这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)ELPs介导的C‑intein融合LfcinB重组质粒的构建：构建以大肠杆菌为宿主的牛乳铁素高效融合表达体系，将pET‑22b‑EI载体插入通过重叠PCR构建的LfcinB，构建pET‑22b‑EI‑LfcinB，利用ELPs可逆相变的特性在C‑Inteins介导的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸残基的LfcinB；(2)根据Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分别与LfcinB串连，构建pET‑24a‑Titin‑LfcinB、pET‑24a‑Telethonin‑LfcinB重组质粒，以大肠杆菌为宿主制备Titin‑LfcinB、Telethonin‑LfcinB两种融合抗菌肽，Titin‑LfcinB：Telethonin‑LfcinB摩尔量比为1‑4:1‑4的比例将两者单体混合后，制备得到ZT‑LfcinB，其中1‑4个单体串联或并联稳定利用相耦合在一起，并利用Native SDS‑PAGE分析显示组装成功。

【技术特征摘要】
1.一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)ELPs介导的C-intein融合LfcinB重组质粒的构建：构建以大肠杆菌为宿主的牛乳铁素高效融合表达体系，将pET-22b-EI载体插入通过重叠PCR构建的LfcinB，构建pET-22b-EI-LfcinB，利用ELPs可逆相变的特性在C-Inteins介导的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸残基的LfcinB；(2)根据Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分别与LfcinB串连，构建pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒，以大肠杆菌为宿主制备Titin-LfcinB、Telethonin-LfcinB两种融合抗菌肽，Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB摩尔量比为1-4:1-4的比例将两者单体混合后，制备得到ZT-LfcinB，其中1-4个单体串联或并联稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：马兴元，李尚洁，郑文云，刘地，陈潇潇，李妍瑶，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31