人Gal‑3密码子优化及其重组蛋白诱导表达方法技术

本发明专利技术涉及一种人Gal‑3重组蛋白诱导表达方法，属于获得肽的基因工程方法技术领域。针对人Gal‑3开放阅读框的密码子进行优化和化学合成，成功构建原核表达重组质粒pET‑25b‑

【技术实现步骤摘要】
人Gal-3密码子优化及其重组蛋白诱导表达方法
本专利技术涉及一种人Gal-3重组蛋白诱导表达方法，属于获得肽的基因工程方法

技术介绍
人半乳糖凝集素（galectin）蛋白家族是动物凝集素的一类，galectin具有大约135个氨基酸组成的高度保守的糖识别结构域（carbohydraterecognitiondomain,CRD），能特异性性识别并结合β-半乳糖苷。目前已从多种动物的组织和细胞中分离到15种galectin，其中半乳糖凝集素-3（galectin-3，简称Gal-3）是galectin家族中唯一的嵌合型代表。Gal-3在正常细胞（如上皮细胞和免疫细胞）和肿瘤细胞中都广泛表达。作为一个多功能蛋白，Gal-3参与细胞生长、分化、细胞黏附、血管发生、肿瘤演进、细胞凋亡、转移等多种生物过程。在20世纪80年代末90年代初，研究人员就发现Gal-3存在于结肠癌、胃癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、颅后窝肿瘤等肿瘤组织，并具有一定的诊断、预后、治疗价值。Gal-3因此成为备受关注的肿瘤诊断和治疗新靶点。目前，包括多糖、Gal-3C（N-端截短型Gal-3）、多肽、抗体、核酸类等多种抑制剂已相继被研发出来，用于抗肿瘤或抗肺纤维化（IPF）等疾病治疗。但如何实现人Gal-3的构建、表达尚未见有报道。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有人类半乳糖凝集素-3表达与合成过程中所存在的上述缺陷，本申请针对人Gal-3开放阅读框的密码子进行优化和化学合成，成功构建原核表达重组质粒pET-25b-Gal3-Homo，并对其重组蛋白诱导表达条件进行了优化。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：人Gal-3重组蛋白诱导表达方法，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人Gal-3ORF码子优化，将优化的ORF进行化学合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制备重组质粒pET-28b-Gal3-Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET-28b-Gal3重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1mLLB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20mLLB培养液中，37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0时，向菌液中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，进行离心，彻底去上清。进一步的，作为优选：步骤（1）中，所述的优化是指：人Gal-3gORF中某种氨基酸所对应的密码子是大肠杆菌中出现频率较高的，则保留该密码子；反之，当使用的密码子是大肠杆菌中出现频率很低的或不出现的时，则对其进行优化，将原密码子修改为大肠杆菌的密码子。步骤①中，所述的琼脂盘中，卡那霉素Kanamycin的含量为50μg•mL-1。步骤②和步骤③中，所述的LB培养液中，卡那霉素Kanamycin的含量为50μg•mL-1。步骤③中，所述的IPTG在菌液中的终浓度为0-1mmol•L-1，添加IPTG后，所述的培养时间为1-4小时。人半乳糖凝集素（galectin）蛋白家族是动物凝集素的一类，galectin具有大约135个氨基酸组成的高度保守的糖识别结构域（carbohydraterecognitiondomain,CRD），能特异性性识别并结合β-半乳糖苷。目前已从多种动物的组织和细胞中分离到15种galectin，其中半乳糖凝集素-3（galectin-3，简称Gal-3）是galectin家族中唯一的嵌合型代表。Gal-3在正常细胞（如上皮细胞和免疫细胞）和肿瘤细胞中都广泛表达。作为一个多功能蛋白，Gal-3参与细胞生长、分化、细胞黏附、血管发生、肿瘤演进、细胞凋亡、转移等多种生物过程。在20世纪80年代末90年代初，研究人员就发现Gal-3存在于结肠癌、胃癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌、卵巢癌、肺癌、淋巴瘤、颅后窝肿瘤等肿瘤组织，并具有一定的诊断、预后、治疗价值。Gal-3因此成为备受关注的肿瘤诊断和治疗新靶点。目前，包括多糖、Gal-3C（N-端截短型Gal-3）、多肽、抗体、核酸类等多种抑制剂已相继被研发出来，用于抗肿瘤或抗肺纤维化（IPF）等疾病治疗。本申请针对人Gal-3开放阅读框的密码子进行优化和化学合成，成功构建原核表达重组质粒pET-25b-Gal-3-Homo，并对其重组蛋白诱导表达条件进行了优化。附图说明图1为本申请中人重组Gal-3诱导表达；图2为本申请中人重组Gal-3可溶性检测、Western-blotting检测。其中，图1中，泳道1、10为未加IPTG的阴性对照，2-5为诱导表达1h，6-9为诱导表达2h，11-14为诱导表达3h，15-18为诱导表达4h；2、6、11、15为0.001mmol•L-1IPTG诱导表达，3、7、12、16为0.01mmol•L-1IPTG诱导表达，4、8、13、17为0.1mmol•L-1IPTG诱导表达，5、9、14、18为1.0mmol•L-1IPTG诱导表达；图2中，1-4为考马斯亮蓝染色、5-8为Western-blotting检测；泳道1、5为未加IPTG的阴性对照，2、6为全菌，3、7为上清，4、8为沉淀。具体实施方式1材料与方法1.1主要材料与试剂大肠杆菌（E.coli）感受态细胞BL21购自天根生化科技有限公司；X-Tractor裂解液购自TAKARA；ProteinLadder、脱脂奶粉、PVDF膜、小鼠抗His-tag抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体、超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；DNA片段合成和载体质粒构建委托苏州金唯智生物科技有限公司。1.2方法1.2.1密码子优化统计实验室常用的重组蛋白原核表达载体，对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人Gal-3ORF码子优化。具体而言，ORF中某氨基酸所对应的密码子是大肠杆菌中出现频率较高的，则保留该密码子。反之，如果使用的密码子是大肠杆菌中出现频率很低的或不出现的，则对其进行优化，即将原密码子修改为大肠杆菌的密码子（具体参见序列1，即人Gal-3g密码子优化前后ORF及其编码氨基酸的推导序列）。将优化的ORF进行合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制备重组质粒pET-28b-Gal3-Homo。1.2.2重组蛋白的诱导表达将pET-28b-Gal-3质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin（简称Kan，50μg•mL-1）的琼脂盘上划线后37℃培养12h，获得大量单菌落。在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1mLLB培养液中（含50μg•mL-1Kan），进行12h的前培养。将前培养按1%的体积接种于20mLLB培养液中（含50μg•mL-1Kan），37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0时，取2mL菌液作为对照样品，将剩余菌液分为4管，加入IPTG，使其终浓度分别为0.001mmol•L-1、0.01mmol•L-1、0.1mmol•L-1、1mmol•L-本文档来自技高网...

【技术保护点】
人Gal‑3重组蛋白诱导表达方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人Gal‑3 ORF码子优化，将优化的ORF进行合成并连接至pET‑28b的Nde I和Xho I克隆位点上，制备重组质粒pET‑28b‑Gal‑3‑Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET‑28b‑Gal‑3重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12 h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1 mL LB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20 mL LB培养液中，37℃震荡培养至OD600 介于0.7～1.0时，向菌液中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，进行离心，彻底去上清。

【技术特征摘要】
1.人Gal-3重组蛋白诱导表达方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）密码子优化：对大肠杆菌20个氨基酸所对应的密码子进行统计，然后对人Gal-3ORF码子优化，将优化的ORF进行合成并连接至pET-28b的NdeI和XhoI克隆位点上，制备重组质粒pET-28b-Gal-3-Homo；（2）重组蛋白的诱导表达①将pET-28b-Gal-3重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，将转化液在含卡那霉素Kanamycin的琼脂盘上划线后37℃培养12h，获得大量单菌落；②在诱导重组蛋白前一天，挑取单菌落接种于1mLLB培养液中，进行12h的前培养；③将前培养按1%的体积接种于20mLLB培养液中，37℃震荡培养至OD600介于0.7～1.0时，向菌液中加入IPTG，然后继续37℃震荡培养后，进行离心，彻底去上清。2.如权利要求1所述的人Gal-3重组蛋白诱导表达方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仙玉，宋源普，罗倩玲，吴青青，蒋桂瑾，岳继萍，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33