一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因及其应用，具体包括一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因、基因片段及其对应的dsRNA的制备、dsRNA在蚜虫防治中的应用。调控蚜虫碳氢化合物合成基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2。基因片段核苷酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。以该片段为模板合成的dsRNA片段经饲喂和显微注射均能显著抑制CYP4G51基因表达水平，注射dsCYP4G51可导致豌豆蚜表皮碳氢化合物减少，导致蚜虫因体内水分过度丧失而死亡。本发明专利技术为基于RNA干扰技术的害虫治理和基于dsRNA的生物杀虫剂开发提供新的分子靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因、基因片段及其对应的dsRNA的制备、dsRNA在蚜虫防治中的应用。
技术介绍
刺吸式蚜虫是世界性的重大农林花卉害虫，其种类繁多、分布广、寄主植物多、繁殖力强，在我国农业主产区造成重大危害,蚜虫防治历来是农林花卉保护中的重点内容。目前，农业生产中蚜虫类的防治仍然主要依赖于化学防治，化学农药的大规模使用不仅使蚜虫的抗药性快速增强，也对生态环境平衡造成巨大考验。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的特定基因沉默机制，随着更多的昆虫全基因组测序的完成，使利用RNAi技术干扰害虫生命活动中的关键基因来防治害虫成为探索新型害虫防治策略的热点之一。基于RNAi技术培育出的转基因棉花和玉米在害虫防治上已初见成效并展现出巨大的应用潜力。RNAi具有高度序列特异性，利用RNAi进行害虫防治具有专一性，对非靶标生物安全。基于RNAi技术的害虫防治策略核心是寻找关键的分子靶标基因并获得高效dsRNA片段序列。陆生昆虫体表蜡质层(上表皮)主要成分是长链(C21-C40)碳氢化合物，其主要作用防止昆虫体内过多的水分损耗。细胞色素P450基因中CYP4G亚家族基因是昆虫特有的，参与碳氢化合物合成的最后一步反应。利用RNAi干扰蚜虫表皮蜡质层中碳氢化合物的合成，从而导致特定基因沉默的蚜虫死于水分过度蒸发，将为有效防治蚜虫类害虫开辟一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因、基因片段及其对应的dsRNA的制备、dsRNA在蚜虫防治中的应用。本专利技术提供的一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因，其核酸序列为SEQIDNO：1；氨基酸序列为SEQIDNO：2。本专利技术提供的一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因的两个基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。本专利技术提供的一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因的两个基因片段的获得方法，包括以下步骤：以含SEQIDNO：1的重组质粒为模板，分别用SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：9、SEQIDNO：10进行PCR扩增，所得产物经AxyPrepDNAGelExtractionKit(Axygen)试剂盒纯化，获得核苷酸序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的基因片段。进一步，以含SEQIDNO：3、SEQIDNO：4的重组质粒为模板，按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒方法，体外转录合成并纯化dsRNA，获得dsCYP4G51-u和dsCYP4G51-d。本专利技术提供的调控蚜虫碳氢化合物合成基因片段dsRNA制备中所用引物序列，包括：SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12。本专利技术提供的调控蚜虫碳氢化合物合成基因片段dsRNA两种导入蚜虫体内的方法，包括：饲喂法和显微注射法。本专利技术提供的调控蚜虫碳氢化合物合成基因片段dsRNA在蚜虫防治中的应用：注射dsCYP4G51可以显著抑制豌豆蚜CYP4G51基因表达，该基因下调导致表皮碳氢化合物减少，进而导致蚜虫对干燥环境高度敏感，因体内水分过度丧失而死亡。附图说明图1是本专利技术实施例提供的调控蚜虫碳氢化合物合成基因的两个基因片段的获得方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的CYP4G51基因序列分析示意图。图中：A：CYP4G51基因外显子、内含子组成形式；B：CYP4G51基因的RNAi策略，包括一个上游靶标区(CYP4G51-u)、一个下游靶标区(CYP4G51-d)和一个独立于两靶标区的定量PCR(qPCR检测区)；C：CYP4G51基因mRNA序列的保守特征基序鉴定。图3是本专利技术实施例提供的饲喂法RNAi示意图。图4是本专利技术实施例提供的饲喂和注射法RNAi试验中dsRNA剂量优化示意图；图中：A：人工饲料中不同浓度dsRNA对CYP4G51转录水平的影响；B：不同dsCYP4G51注射体积对CYP4G51转录水平的影响。星号代表处理组CYP4G51相对表达量显著低于对照组(*P<0.05，**P<0.01，Student’st-test)。图5是本专利技术实施例提供的对3龄若蚜注射dsCYP4G51后，CYP4G51基因的RNA干扰效率检测示意图；图中：进行二次注射可显著延长对CYP4G51基因的表达抑制效果。内参为核糖体蛋白基因(rps20)为qPCR的内参基因。星号代表处理组和对照组之间HC含量有显著差异(P<0.01，Student’st-test)。图6是本专利技术实施例提供的CYP4G51基因被沉默后，豌豆蚜HC含量变化示意图；图中：注射dsCYP4G51-d可显著降低体内和体表HC含量。n.s代表无显著性差异，星号代表处理组和对照组之间HC含量有显著差异(P<0.01，Student’st-test)。图7是本专利技术实施例提供的豌豆蚜CYP4G51基因被沉默后在干燥环境中的死亡率(A)及死亡表型(B)示意图；图中：在25℃干燥胁迫下注射dsCYP4G51-d的豌豆蚜死亡率显著升高。n.s代表无显著性差异，星号代表处理组和对照组之间HC含量有显著差异(P<0.01，Student’st-test)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的调控蚜虫碳氢化合物合成基因的两个基因片段的获得方法包括以下步骤：S101：以含SEQIDNO：1的重组质粒为模板，分别用SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：9、SEQIDNO：10进行PCR扩增，所得产物经AxyPrepDNAGelExtractionKit(Axygen)试剂盒纯化，获得核苷酸序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的基因片段；S102：以含SEQIDNO：3、SEQIDNO：4的重组质粒为模板，按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒方法，体外转录合成并纯化dsRNA，获得dsCYP4G51-u和dsCYP4G51-d。下面结合具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步的描述。实施例1：豌豆蚜CYP4G51基因生物信息学分析与cDNA序列获得基于豌豆蚜基因组数据库，利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BlastN工具对豌豆蚜细胞色素P450基因进行搜索比对，发现只有一个CYP4G基因，为CYP4G51(据P450命名委员会)，其GenBank登录号为XM_001944170。该基因由13个外显子剪切而成(图2A)，开放阅读框长1701bp，编码566个氨基酸残基，含P450基因特征基序(图2C)，认定其属于4G亚家族基因，设计RNAi策略(图2B)。利用PCR技术获得其开放阅读框(ORF)并克隆至pGEMT载体，获得含SEQIDNO：1的重组质粒。实施例2：豌豆蚜CYP4G51基因片段及其相应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因，其核酸序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因，其核酸序列为SEQIDNO：1。2.一种调控蚜虫碳氢化合物合成基因的两个基因片段，其核苷酸序列为SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。3.如权利要求2所述基因片段的获得方法，包括以下步骤：以含SEQIDNO：1的重组质粒为模板，分别用SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：9、SEQIDNO：10进行PCR扩增，所得产物经AxyPrepDNAGelExtractionKit(Axygen)试剂盒纯化，获得核苷酸序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的基因片段。4.如权利要求2所述基因片段对应的dsRNA的合成方法，包括以下步骤：以含SEQIDNO：3、SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘同先，陈楠，樊永亮，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61