水稻miRNA-miR874基因及前体基因和在提高水稻对重金属胁迫耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻转基因领域，尤其涉及水稻miRNA‑miR874基因及其前体基因和其在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。本发明专利技术利用荧光定量PCR及生物信息学等方法，在水稻幼苗根中筛选得到一种新的miRNA—miR874。miR874基因上游的启动子区通过预测发现存在重金属响应元件（TGCRCNC）。实时定量PCR实验显示，miR874在镉胁迫下表达受到显著上调。本发明专利技术进而通过包含所述水稻miRNA的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的水稻转基因株系。通过转基因手段发现该miRNA具有显著提高水稻对镉耐受性的作用。

【技术实现步骤摘要】
水稻miRNA-miR874基因及前体基因和在提高水稻对重金属胁迫耐受性中的应用
本专利技术涉及水稻转基因领域，尤其涉及水稻miRNA-miR874基因及其前体基因和其在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。
技术介绍
近年来，随着我国工业化和城市化进程的不断发展，重金属(镉、铅、汞等)引起的土壤污染形势日趋严峻，对生态环境、食品安全和农业的可持续发展构成严重威胁。据报道我国受重金属污染的耕地近3亿亩，约占全国农田总数的1/6；全国每年因重金属污染粮食达1200万吨，造成的直接经济损失超过200亿元(韩少华等，2011)。浙江省受三废污染的耕地面积达33.33万公顷，占全省耕地总面积的20％以上，富阳郊区及富春江沿岸某些地段因采矿和冶炼活动引起的农田污染面积达数千亩，绍兴、诸暨、天台、黄岩、温州、建德等地也存在铅锌矿污染土壤。而且，由于重金属在土壤中的存留时间短则数十年(如镉)，长则数万年(如铅)，要彻底解决现有问题并非易事。因此，如何在轻度重金属污染的土壤中进行农作物的安全生产，如何利用植物进行大规模污染土壤的修复，这对保障农产品安全、生态安全和人民健康，促进农业生产的可持续发展意义重大。目前对植物重金属转运和解毒机制的研究主要集中在植物螯合肽(Phytochelatin，PC)、金属硫蛋白(MT)、阳离子/H+转运蛋白CAX2等。但这些基因的表达调控机制并不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类单链、长度约为20-24nt的内源性RNA，对特定基因转录后水平的表达具有重要调控作用。植物中，miRNA调节植物的生长发育，并参与多种生物(病原微生物)和非生物胁迫(盐胁迫、冷胁迫、干旱及重金属等)应答。近年来的研究表明，miRNA在植物重金属胁迫响应过程中扮演着重要角色。甘蓝型油菜中，miR156、miR171、miR393以及miR396a的表达受镉的抑制(Xie,F.L.,Huang,S.Q.,Guo,K.,Xiang,A.L.,Zhu,Y.Y.,Nie,L.,Yang,Z.M.ComputationalidentificationofnovelmicroRNAsandtargetsinBrassicanapus.FEBSLett,2007,581:1464–1474.)。蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表达可受镉、汞、铝的诱导与调节(Zhao,S.Z.,Si,Q.H.,Zhi,M.Y.BioinformaticidentificationandexpressionanalysisofnewmicroRNAsfromMedicagotruncatula.Biochem.Biophys.Res.Commun,2008,374:538–542.)。Huang等(2009)构建镉胁迫下水稻幼苗的smallRNA文库，克隆了19个新的miRNA，并发现其中多数miRNA在镉胁迫下表达发生变化。如水稻幼苗根中miR604在镉处理下表达下调，其靶基因脂转移蛋白表达上升。而脂转移蛋白参与植物多种抗逆性反应并介导植物激素信号转导等过程(Huang,S.Q.,Peng,J.,Qiu,C.X.,Yang,Z.M.Heavymetal-regulatednewmicroRNAsfromrice.J.Inorg.Biochem,2009,103:282e287.)。Zhou等(2012)利用Solexa高通量测序技术发现了苜蓿中52个新的汞胁迫相关的miRNA(Zhou,Z.S.,Zeng,H.Q.,Liu,Z.P.,Yang,Z.M.Genome‐wideidentificationofMedicagotruncatulamicroRNAsandtheirtargetsrevealstheirdifferentialregulationbyheavymetal.PlantCellEnviron,2012,35:86-99)。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的一个目的是提供水稻miRNA-miR874基因及其前体基因。本专利技术的另外一个目的是提供该两个基因在在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：水稻miRNA-miR874基因，miR874基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。水稻miRNA-miR874基因的前体基因，前体基因的基因序列如SEQIDNO.2所示。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：上述的水稻miRNA-miR874基因或水稻miRNA-miR874基因的前体基因在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。一种转化载体，该转化载体含所述的水稻miRNA-miR874基因或含所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。一种感受态细胞，其特征在于该感受态细胞含所述的水稻miRNA-miR874基因或含所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。一种抗重金属镉水稻的培育方法，该方法包括以下的步骤：1)以野生型水稻幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到前体基因的序列；水稻miRNA-miR874基因，碱基序列如SEQIDNO.1所示；该基因的前体基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；2)将前体基因DNA与pMD19-T载体进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR874；3)将提取的质粒pMD19-miR874和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR874酶切后，割胶回收DNA片段；接着用T4连接酶连接；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定；将正确的植物表达载体p1301-miR874导入农杆菌感受态细胞EHA105；摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定；4)经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR874，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤；然后将愈伤组织进行选择培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上进行培养，待再生小苗长成将其移到生根培养基上壮苗，最后将转基因苗挑出进行炼苗、移栽，挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。作为优选，所述的步骤1)前体基因的制备方法如下：1)提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA；2)根据前体序列，分别在前体发夹结构两端约100bp处设计引物，所设引物如下：miR874-F，5’-CGGGGTACCTGATCCAAGAACTCTGACT-3’miR874-R，5'-AACTGCAGATACGTTTTTTGTACACAT-3'；3)接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增前体基因；PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCRbuffer5μl、10mMdNTPs4μl、10μM正向引物miR8本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻miRNA‑miR874基因，其特征在于：miR874基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.水稻miRNA-miR874基因，其特征在于：miR874基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因，其特征在于：前体基因的基因序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因在提高水稻对重金属镉胁迫耐受性中的应用。4.一种转化载体，其特征在于该转化载体含权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或含权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。5.一种感受态细胞，其特征在于该感受态细胞含权利要求1所述的水稻miRNA-miR874基因或含权利要求2所述的水稻miRNA-miR874基因的前体基因。6.一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）以野生型水稻幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩增到前体基因的序列；水稻miRNA-miR874基因，碱基序列如SEQIDNO.1所示；该基因的前体基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；2）将前体基因DNA与pMD19-T载体进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR874；3）将提取的质粒pMD19-miR874和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR874酶切后，割胶回收DNA片段；接着用T4连接酶连接；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定；将正确的植物表达载体p1301-miR874导入农杆菌感受态细胞EHA105；摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定；4）经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR874，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤；然后将愈伤组织进行选择培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上进行培养，待再生小苗长成将其移到生根培养基上壮苗，最后将转基因苗挑出进行炼苗、移栽，挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。7.根据权利要求1所述的一种抗重金属镉水稻的培育方法，其特征在于步骤1）前体基因的制备方法如下：1）提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA；2）根据前体序列，分别在前体发夹结构两端约100bp处设计引物，所设引物如下：miR874-F，5’-CGGGGTACCTGATCCAAGAACTCTGACT-3’miR874-R，5'-AACTGCAGATACGTTTTTTGTACACAT-3'；3）接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增前体基因；PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCRbuffer5μl、10mMdNTPs4μl、10μM正向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁艳菲，朱诚，孙骏威，王飞娟，蒋晗，江琼，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33