一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法技术

本发明专利技术公开一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，具体步骤如下：（1）斑重唇鱼线粒体Cyt

【技术实现步骤摘要】
一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法。
技术介绍
斑重唇鱼DiptychusmaculatesSteindachner，又名斑黄瓜鱼，隶属于鲤科Cyprinidae，裂腹鱼亚科Schizothoracinae，重唇鱼属Diptychus，为冷水杂食性鱼类，常栖息于有沙砾的河流及山间支流中。斑重唇鱼具有怀卵量少、生殖力较低、生长速度缓慢、性成熟晚等繁殖生物学特性，一旦过度捕捞，资源将难以恢复。近年来由于受到环境变化和人类活动影响，斑重唇鱼分布区域正在逐渐缩小，种群数量急剧下降，已被列为新疆维吾尔自治区II级水生野生保护动物。关于斑重唇鱼的研究，多集中于繁殖生物学和资源生物学领域，而采用分子生物学技术对斑重唇鱼的研究不多，且多集中在线粒体部分序列的比较研究，关于其线粒体基因组全序列扩增的方法未见报道。考虑到目前斑重唇鱼遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量有限，开展其线粒体基因组全序列的研究就显得十分必要。目前扩增线粒体基因组全序列的方法大多采用引物步移法，即参考同源序列在保守区设计引物扩增序列并测序，在测出的序列两端继续设计引物并扩增测序，如此循环重复，最后将获得的序列片段进行拼接，获得线粒体全序列。为保证准确性和可读性，常规PCR每次扩增序列长度在500-600bp左右，而脊椎动物线粒体基因组多在15kb以上，因此至少需要设计20-30多对引物进行扩增，这种方法不仅费时费力，而且在后期凌乱的序列拼接过程中也容易出现错误。而本专利涉及的LA-PCR方法，具有扩增片段长、高保真性等特点，采用该方法对斑重唇线粒体基因组进行扩增国内尚属首次。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供的斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法包括以下步骤：(1)斑重唇鱼线粒体Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段的扩增.(2)斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增。所述的斑重唇鱼线粒体基因组Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段的扩增方法，包括以下几个步骤：(1)用于扩增Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段引物的筛选，选取了扩增Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因的引物分别为：Cytb：上游引物为5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物为5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；COI：上游引物为5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物为5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；ND4：上游引物为5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物为5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；16SrRNA：上游引物为5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物为5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。(2)四个基因片段扩增的PCR反应：反应总体系为50μL，其中10×buffer5.0μL，Mg2+终浓度为2.0mM，dNTP(2.5mM)4μL，Taq聚合酶2units，引物(10μM)各2μL，斑重唇鱼基因组DNA2μL(1μg)，加灭菌水至终体积50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，57℃(Cytb和16SrRNA)、54℃(COI)、56℃(ND4)退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。(3)琼脂糖凝胶电泳检测：称量0.7g琼脂糖加入70mL1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热至琼脂粉完全溶解且无泡沫，冷却至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀避免产生气泡。待冷却至不烫手时将胶缓缓倒入胶槽内，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，将2μL斑重唇鱼DNA样本与0.5μL6×DNAloadingbuffer混合后依次上样，最后点上6μLDL2000Marker后开始电泳。电泳电压设定为120V，电流400mA，时间30min。电泳完毕在凝胶成像系统照相，通过调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片。所述的斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增。包括以下几个步骤：(1)斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增引物的设计：以获得的Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因序列片段为模板，在其两端分别设计4对LA-PCR引物，用于扩增斑重唇鱼线粒体基因组剩余部分序列；以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的环形区域设计第一对引物P1，上游引物为5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物为5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；以COI基因片段为起点、ND4基因片段为终点的环形区域设计第二对引物P2，上游引物为5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物为5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；以ND4基因片段为起点、Cytb基因片段为终点的环形区域设计第三对引物P3，上游引物为5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物为5’-ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；以Cytb基因片段为起点、16SrRNA基因片段为终点的环形区域设计第四对引物P4，上游引物为5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物为5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’。(2)根据设计的4对LA-PCR引物扩增斑重唇鱼线粒体基因组全序列，使用宝生物工程(大连)有限公司的LATaq聚合酶；LA-PCR反应：反应总体系为50μL，其中10×LAPCRbufferII5.0μL，Mg2+终浓度为2.0mM，dNTP(2.5mM)8μL，LATaq聚合酶2units，引物(20μM)各1μL，斑重唇鱼基因组DNA2.5ng(50ng/μL)，加灭菌水至终体积50μL。LA-PCR反应条件为：95℃预变性2min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，57℃(P1)、60℃(P2)、58℃(P3)、59℃(P4)退火30s，72℃延伸4(P1)、6(P2)、3(P3)、5(P4)min，最后72℃再延伸10min。4对LA-PCR引物扩增分别获得目的序列片段长度分别为4kb、6kb、3.1kb和4.5kb。(3)采用引物步移法，分别以扩增的4个大片段序列为模板，每隔大约500bp左右，设计一条测序引物对其进行分段扩增，28条测序引物序列信息如下：以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的环形区域6条测序引物为：5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’5’-CCACCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）斑重唇鱼线粒体Cyt

【技术特征摘要】
1.斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）斑重唇鱼线粒体Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段的扩增；（2）斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增。2.根据权利要求1所述的斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，其特征在于，步骤（1）斑重唇鱼线粒体Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段的扩增，具体包括以下几个步骤：（1）用于扩增Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因片段引物的筛选，选取了扩增Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因的引物分别为：Cytb：上游引物为5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物为5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；COI：上游引物为5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物为5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；ND4：上游引物为5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物为5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；16SrRNA：上游引物为5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物为5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’；（2）四个基因片段扩增的PCR反应：反应总体系为50μL，其中10×buffer5.0μL，Mg2+终浓度为2.0mM，dNTP（2.5mM）4μL，Taq聚合酶2units，引物（10μM）各2μL，斑重唇鱼基因组DNA2μL（1μg），加灭菌水至终体积50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，57℃（Cytb和16SrRNA）、54℃（COI）、56℃（ND4）退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min；（3）琼脂糖凝胶电泳检测：称量0.7g琼脂糖加入70mL1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热至琼脂粉完全溶解且无泡沫，冷却至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀避免产生气泡；待冷却至不烫手时将胶缓缓倒入胶槽内，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，将2μL斑重唇鱼DNA样本与0.5μL6×DNAloadingbuffer混合后依次上样，最后点上6μLDL2000Marker后开始电泳；电泳电压设定为120V，电流400mA，时间30min；电泳完毕在凝胶成像系统照相，通过调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片。3.根据权利要求1所述的斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，其特征在于，步骤（2）所述的斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增，包括以下几个步骤：（1）斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增引物的设计：以获得的Cytb、COI、ND4和16SrRNA四个基因序列片段为模板，在其两端分别设计4对LA-PCR引物，用于扩增斑重唇鱼线粒体基因组剩余部分序列；以16SrRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的环形区域设计第一对引物P1，上游引物为5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物为5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；以COI基因片段为起点、ND4基因片段为终点的环形区域设计第二对引物P2，上游引物为5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物为5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；以ND4基因片段为起点、Cytb基因片段为终点的环形区域设...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨天燕，孟玮，高天翔，刘云国，韩志强，蔡珊珊，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33