一种深海细菌木糖苷酶CmXynB1及其表达纯化、晶体结构和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体为一种深海细菌木糖苷酶CmXynB1及其表达纯化、晶体结构和应用。本发明专利技术涉及木糖苷酶基因CmXynB1来自深海细菌E4A9

【技术实现步骤摘要】
一种深海细菌木糖苷酶CmXynB1及其表达纯化、晶体结构和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种深海细菌蛋白木糖苷酶及其表达纯化、晶体结构和在糖苷类药物制备、工业酶制剂中的应用。
技术介绍
木糖苷酶(xylosidaseEC3.2.1.37)广泛存在于微生物中，能够催化低木聚糖降解为木糖等小分子，对纤维素和半纤维素的降解有重要意义。木糖苷酶具有许多优良的特性，例如能够催化糖苷的水解以改进糖苷类药物的制备工艺，能够在一定的酸性条件下保持较高的活性等，使得木糖苷酶在工业生产中成为重要的催化剂。木糖苷酶可广泛应用于药物制备、食品加工及食品风味改良、废水处理、造纸工业等领域。海洋来源的糖苷酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐低温等等，因此，从海洋微生物中筛选出独具特性的糖苷酶就成了糖苷类药物制备及开发新型工业酶制剂的一个重要方向。本专利技术利用结晶的方法得到了木糖苷酶CmXynB1的晶体结构并进行了分析。CmXynB1晶体结构可在手性药物前体筛选、工业酶制剂中底物改造及提高酶活方面具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1及其表达纯化、晶体结构和在糖苷类药物制备、工业酶制剂中的应用。本专利技术涉及来源于深海细菌宏基因组CroceicoccusmarinusE4A9T的木糖苷酶CmXynB1进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及所述木糖苷酶CmXynB1第4位到第484位氨基酸的三维晶体结构及其在工业方面的应用。本专利技术涉及来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1，其含有485个氨基酸，分子量为53.35kDa；其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术首先将来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1进行基因工程改造，将其全长基因克隆在pet28b载体上。本专利技术优先选择了使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其它细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优先选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其它标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。本专利技术提供表达和纯化来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1的方法，该方法包括：构建融合未突变的CmXynB1全长基因的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白CmXynB1，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法(优选亲和层析的方法)分理处目的蛋白，再过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的CmXynB1的蛋白。其中，亲和层析的平衡缓冲液优先选择50mMTris,pH8.0；500mMNaCl；5％甘油；10mM咪唑；2mMβ-Me；0.2mMPMSF，洗脱缓冲液优先选择50mMTris,pH8.0；500mMNaCl；5％甘油；250mM咪唑；2mMβ-Me。凝胶过滤层析的缓冲液优先选择20mMTris，pH7.4；100mMNaCl；2mMDTT。其中，扩增木糖苷酶全基因的上游引物为：CmXynB1F(5’-GGCGGATCCATGACTTCAGACCTTATCGCGAAGCTG-3’，BamHI)(SEQ.ID.NO.3)下游引物为：CmXynB1R(5’-AAACTCGAGCTACGATGACACACGCGTTATCTCGAT-3’，XhoI)(SEQ.ID.NO.4)。表达质粒为pET28b，转化方法为CaCl2转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)plus。本专利技术还提供对上述得到的木糖苷酶CmXynB1进行结晶的方法，所述的方法包括：将木糖苷酶CmXynB1浓缩至3-15mg/ml，在4-30℃下用气相扩散法筛选晶体生长条件，优先选择使用15-20摄氏度。同时，加入适量底物β-对硝基苯酚木糖苷进行共结晶。本专利技术还提供衍射性能良好的木糖苷酶CmXynB1蛋白质的晶体。本专利技术还提供木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，该结构描述了木糖苷酶CmXynB1的二级结构组成，肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对木糖苷酶CmXynB1蛋白进行衍射，得到木糖苷酶CmXynB1蛋白的晶体衍射数据，并通过硒代的方法用Phenix软件确定相位，用Refmac及Coot对结构进行修正，最终得到木糖苷酶CmXynB1蛋白的三维结构。在具体的实施方式中，提供了木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少一部分的原子坐标，或者任何与该坐标中至少40％氨基酸残基的主链碳骨架的原子三维坐标的平均根方差小于或等于的结构。本专利技术获得了优选木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，分辨率为其晶体结构空间群为P21。晶胞参数为：α＝γ＝90°，β＝98.71°。在一具体的实施方式中，所述的木糖苷酶CmXynB1的三维结构在一个晶体学不对称单位有两个蛋白分子。该结构共由22个β折叠和10个α螺旋组成，其活性中心是典型的(β/α)8桶型结构，但是在其碳末端由10个β折叠构成缩短的发夹结构，该发夹结构与其底物的作用密切相关。其中，8个β折叠位于中心，10个α螺旋围绕在β折叠的周围,其余的β折叠在C末端形成一个发夹结构。其中，β折叠1，即含Leu5-Ala13的氨基酸区段，β折叠2，即含Gly18-Met20的氨基酸区段，β折叠3,即含His24-Gly28的氨基酸区段，α螺旋1，即含Ile42-Ala49的氨基酸区段，β折叠4，即含Thr52-Ser56的氨基酸区段，α螺旋2，即含Asp82-Tyr86的氨基酸区段，α螺旋3，即含Phe88-Ile101的氨基酸区段，β折叠5，即含Asn104-Ile109的氨基酸区段，α螺旋4，即含Asp122-Cys139的氨基酸区段，β折叠6，即含Ser150-Gly155的氨基酸区段，α螺旋5，即含Thr168-Asp187的氨基酸区段，β折叠7，即含Lys191-Val197的氨基酸区段，α螺旋6，即含Arg207-Gln217的氨基酸区段，β折叠8，即含Asp222-Gly230的氨基酸区段，α螺旋7，即含Met237-Tyr253的氨基酸区段，β折叠9，即含Glu259-Ser266的氨基酸区段，α螺旋8，即含Glu276-Gln292的氨基酸区段，β折叠10，即含Lys298-Phe302的氨基酸区段，β折叠11，即含Gly307-Asp309的氨基酸区段，β折叠12，即含Phe314-Asp316的氨基酸区段，α螺旋9，即含Gln328-Ala342的氨基酸区段，β折叠13，即含Thr344-Thr350的氨基酸区段，β折叠14，即含Thr364-Gly356的氨基酸区段,β折叠14，即含Thr364-Gly356的氨基酸区段,β折叠14，即含Thr364-Gly356的氨基酸区段,β折叠14，即含Gly356-Thr364的氨基酸区段,β折叠15，即含Asp368-Tyr377的氨基酸区段,α螺旋10,即含Pro380-Thr385的氨基酸区段,β折叠16，即含Asp390-Phe394的氨基酸区段,β本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1，其特征在于，含有485个氨基酸，分子量为53.35kDa；其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1，其特征在于，含有485个氨基酸，分子量为53.35kDa；其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.一种如权利要求1所述的来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1的表达和纯化方法，其特征在于，包括：构建融合未突变的CmXynB1全长基因的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白CmXynB1，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分理处目的蛋白，再过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的CmXynB1的蛋白；其中，扩增木糖苷酶全基因的上游引物为：CmXynB1F(5’-GGCGGATCCATGACTTCAGACCTTATCGCGAAGCTG-3’，BamHI)下游引物为：CmXynB1R(5’-AAACTCGAGCTACGATGACACACGCGTTATCTCGAT-3’，XhoI)；表达质粒为pET28b，转化方法为CaCl2转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)plus。3.一种如权利要求1所述的来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1的结晶方法，其特征在于，具体步骤为：将木糖苷酶CmXynB1浓缩至3-15mg/ml，在4-30℃下用气相扩散法筛选晶体生长条件，同时，加入适量底物β-对硝基苯酚木糖苷进行共结晶。4.一种如权利要求1所述的来源于深海细菌宏基因组的木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，其特征在于，所述晶体三维结构中的原子表中至少40%的原子坐标，或者至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.8Å。5.根据权利要求5所述的木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，其特征在于，分辨率为1.8Å；其中，晶体结构空间群为P21，一个不对称单位仅有两个分子；晶胞参数为：a＝48.91Å，b＝95.91Å，c＝100.91Å，α＝γ＝90°，β＝98.71°。6.根据权利要求2所述的木糖苷酶CmXynB1的晶体三维结构，其特征在于，由22个β折叠和8个α螺旋组成；其中，8个β折叠位于中心，10个α螺旋围绕在β折叠的周围,其余的β折叠在C末端形成一个发夹结构；其中，β折叠1，即含Leu5-Ala13的氨基酸区段，β折叠2，即含Gly18...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继喜，申彦芳，梅谱成，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31